兴安杜鹃与迎红杜鹃的群体遗传学研究

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杜鹃花属(Rhododendron L.)是杜鹃花科(Ericaceae Juss.)中最大的属,也是中国-喜马拉雅植物区系中的大属之一,属内很多物种在园艺学上具有重要价值。该属在世界范围内包含约1000种,中国产571种,主要分布于西南和华南地区,其中409种为我国特有种。兴安杜鹃(R.dauricum L.)和迎红杜鹃(R.mucronulatum Turcz.)是该属中的两个近缘种,兴安杜鹃为半常绿灌木,在国内广泛分布于长白山区和大兴安岭地区,而迎红杜鹃为落叶灌木,是华北地区的常见物种,在东北地区也有分布。与迎红杜鹃相比较,兴安杜鹃更能适应较寒冷的环境,因此这两个物种是研究适应性进化的良好材料。本论文中对27个兴安杜鹃野生居群和12个迎红杜鹃野生居群的群体材料进行叶绿体基因片段扩增和简化基因组测序(SLAF-seq),进而对两个物种的遗传多样性、遗传结构、分歧时间及物种间的分化水平进行分析,有助于揭示物种多样性的形成及环境适应性机制。在群体遗传学研究中,除了基于二代测序的SNP分子标记以外,SSR分子标记一直也是群体遗传学研究中常用的分子标记,但是使用不同数量的SSR分子标记对遗传多样性分析结果会产生影响。为了研究SSR分子标记的数量对计算群体遗传学相关参数的影响,本论文基于群体SLAF-seq测序数据,在基因组水平上随机多次产生了包含不同数量SSR位点的数据集,从而分析SSR分子标记的数量对计算遗传多样性参数稳定性的影响。另外,本研究设计了26对在兴安杜鹃和迎红杜鹃,甚至是亲缘关系较远的牛皮杜鹃(R.aureum Georgi)中扩增效率较高且具有较高多态性的SSR引物。主要结果如下:(1)基于4个叶绿体基因片段,在兴安杜鹃群体中,检测出15个多态位点和10个单倍型,单倍型多态性(Hd)和核苷酸多态性(π)分别为0.6610和0.0018。而在迎红杜鹃中仅仅检测出1个单倍型。基于基因组SNPs,兴安杜鹃群体的核苷酸多态性为0.2450 x 10-3,迎红杜鹃的核苷酸多态性为0.1850 x 10-3,表明迎红杜鹃群体的核苷酸多态性低于兴安杜鹃的核苷酸多态性。(2)基于叶绿体构建的单倍型网络图并没有将兴安杜鹃和迎红杜鹃分开;基于简化基因组的STRUCTURE分析结果显示最佳K值为2。当K=2时,兴安杜鹃居群与迎红杜鹃居群之间发生明显分化,而采集自长白山脉的兴安杜鹃居群(SL,LTS,MH,HC,LJ,CB,WT,JA)出现了混合的遗传背景。(3)基于叶绿体基因构建的ML树与基于简化基因组SNPs构建的系统发育树不一致。虽然基于叶绿体基因构建的系统发育树将所有个体分成了两个大支,但是采集自长白山脉的兴安杜鹃个体与迎红杜鹃聚在一个独立分支上。Tree Mix分析发现兴安杜鹃的这些居群中检测到了来自于迎红杜鹃的基因流。(4)基于简化基因组的AMOVA分析显示主要的分化来自于物种间(57.98%),表明物种间分化水平明显。另外,基于叶绿体和简化基因组的物种间Fst值分别为0.3541和0.2886。基于简化基因组的SNPs推断兴安杜鹃和迎红杜鹃的分歧时间为32.41 MYA(95%HPD interval:17.54-53.11 MYA),处于渐新世早期。(5)在634,881个SNP位点中筛选出292个受选择候选基因,这些基因编码的蛋白参与多个植物代谢通路,如:半胱氨酸和蛋氨酸代谢(Cysteine and methionine metabolism,ko00270);柠檬酸循环(Citrate cycle(TCA cycle),ko00020);糖酵解(Glycolysis/Gluconeogenesis,ko00010);丙酮酸盐代谢(Pyruvate metabolism,ko00620);蔗糖与淀粉代谢(Starch and sucrose metabolism,ko00500);氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids,ko01230);碳代谢(Carbon metabolism,ko01200);N-糖基化生物合成(N-Glycan biosynthesis,ko00510);类固醇生物合成(Steroid biosynthesis,ko00100);α-亚麻酸的代谢(alpha-Linolenic acid metabolism,ko00592,);氰氨基酸代谢(Cyanoamino acid metabolism,ko00460);谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism,ko00480)和牛磺酸和次牛磺酸代谢(Taurine and hypotaurine metabolism,ko00430),这些基因可能与兴安杜鹃适应较冷的环境相关。(6)基于兴安杜鹃与迎红杜鹃群体SLAF数据一共筛选出265个SSR位点,从这些位点中重复随机选择包含不同数目SSR位点的数据集,并计算相关的群体遗传学参数,通过分析发现,当SSR位点小于11个时,遗传多样性参数Ar和Hs与实际值的绝对误差存在显著差异(p<0.01)。而当SSR位点只有5个或者6个时,居群聚类发生错误的概率达到50%。(7)在265个具有多态性的微卫星位点中,设计并经过PCR验证了26对SSR引物目的产物的多态性,其中有23对引物的目标产物的重复单元为二核苷酸,其余为三核苷酸(2个)和四核苷酸(1个)。本论文研究结果揭示了兴安杜鹃和迎红杜鹃的遗传多样性及其遗传结构,不仅阐明了兴安杜鹃与迎红杜鹃的遗传分化,为中国东北地区种子植物分布格局的历史成因提供了案例,也为兴安杜鹃和迎红杜鹃的野生资源保护提供了科学依据。本论文还基于二代测序技术在兴安杜鹃和迎红杜鹃中批量开发具有多态性的SSR引物,这使在非模式物种(无参考基因组)中批量开发具有多态性SSR引物更为快捷,便于群体遗传学的研究。
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