小肽是奶牛的重要氮源和牛奶中乳蛋白形成的重要前体物,并且能被胃肠道大量吸收。本研究围绕奶牛瓣胃上皮细胞(Omasal epithelial cells, OEC)及小肽转运载体1 (Peptide transporter 1, PepT1),探索瓣胃及PepT1吸收小肽的机制。首先,成功建立了奶牛OEC体外培养模型；其次,研究了OEC对小肽摄取和转运的机制,发现PepTl在奶牛OEC吸收小肽过程中发挥着重要作用；最后,比对分析了奶牛PepT1 (bovine PepT1, bPepT1)的结构特征,并对其表达功能特征和分布规律进行了研究。主要研究结果如下：1.奶牛OEC体外培养模型的建立及其功能检测该部分旨在建立奶牛OEC体外培养模型。瓣胃组织取自4头新生的中国荷斯坦犊牛,采用2.5%胰蛋白酶连续消化分离得到游离细胞,将细胞培养在含10%血清、10ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL庆大霉素和2.5 μg/mL两性霉素B的DMEM高糖培养基中,通过H&E组织染色发现瓣胃上皮层已完全被消化酶分离下来。利用酶差消化法和相差贴壁法对OEC进行纯化,纯化后的OEC呈现典型的上皮细胞铺路石状形态特征,纯度达90%以上。通过免疫荧光染色检测到上皮细胞内角蛋白CKl8和PepT1的表达,通过反转录PCR方法在上皮细胞中检测到存在PepT1的mRNA表达,通过扫描电镜和透射电镜观察到上皮细胞表面存在微绒毛,并且在细胞间有桥粒、紧密连接结构、基底层折叠和张力细丝等典型上皮细胞的结构出现,并存在极化现象；细胞具有典型的“S”型细胞增长曲线,且至少可传至10代。通过对OEC摄取2.5 mM二肽glycylsarcosine (Gly-Sar,甘氨酸-肌氨酸)功能进行研究,结果发现OEC可完整地摄取Gly-Sar并呈现pH依赖性(最佳pH 5.5-6.5)、时间依赖性(在10 min时达到饱和)、浓度依赖性和温度依赖性；此外还发现Gly-Sar在浓度较低时(<1.5 mM),通过PepT1载体途径的转运量较大,说明低浓度小肽存在时PepTl更易发挥作用。另外,这种摄取可以被Met-Gly二肽竞争性的抑制,而不被游离氨基酸(Free amino acid, FAA)抑制。综上所述,OEC体外培养模型已成功建立,并且PepT1在其摄取小肽过程中发挥着重要作用,所培养的OEC可以作为体外研究瓣胃小肽吸收功能的模型。2. PepTl在奶牛OEC吸收二肽中的功能及影响因素该部分旨在研究奶牛OEC对Gly-Sar的摄取、转运及其影响因素,探讨PepTl基因在OEC吸收小肽过程中发挥的作用。免疫荧光化学检测发现铺满的OEC细胞层有紧密连接蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达,尤其在细胞连接处表达量更多；检测铺于Transwell滤膜OEC细胞层的电阻值和渗透性发现细胞层的电阻值在一周时达到平台期,荧光素钠的渗透率为0.63%,显著低于对照组(无细胞组,12%),说明细胞层已紧密形成,可以进行转运试验。通过控制孵育细胞的温度、pH、时间、浓度、二乙烯焦碳酸酯(DEPC)和竞争肽及LPS的存在与否等不同条件,检测下室中的小肽量,结果发现OEC在37℃时的转运量显著高于4℃(P<0.05),并具有pH依赖性,OEC对Gly-Sar的摄取和转运可以被PepTl的His残基抑制剂DEPC显著抑制(P<0.05),也可被其他竞争性二肽抑制(P<0.05),但不被FAA抑制；从上室转运到下室的小肽量为反方向的3倍,说明小肽转运存在方向性。另外,siRNA特异性的干扰OEC的PepTl基因表达可显著降低其对Gly-Sar的吸收(P<0.05),然而过表达OEC的PepTl可以显著增加Gly-Sar的吸收(P<0.05)；此外结果还发现不同种类(Gly-Sar、Lys-Lys和Met-Lys)和不同浓度(0.25 mM、2.5 mM和10 mM)的小肽可显著提高OEC的PepT1蛋白表达量(P<0.05)。此外,结果还发现LPS可以上调PepT1基因的表达,降低膜电阻,增加OEC对小肽的转运量；另外,通过对瘤胃上皮细胞层与OEC细胞层的小肽转运能力进行比较,发现瓣胃上皮的小肽转运能力显著高于瘤胃。综上所述,PepT1基因可能在奶牛OEC吸收小肽过程中起着重要作用,并受LPS的影响。3.奶牛PepT1的功能表达和分布规律通过对克隆的全长奶牛bPepT1氨基酸序列与其他25个物种进行序列比对和结构预测分析,发现bPepT1与其他物种PepT1的氨基酸序列具有较高的同源性,同源性由高到低依次为山羊(96.2%)、绵羊(95.2%)、马(85.9%)、猪(85.6%)、狗(83.4%)、人(83.0%)、鼠类(82%-83%)、猴类(81%-83%)、兔(78.6%)、禽类(64%)、鱼类(56%-61%)；奶牛bPepT1蛋白结构中含有12个跨膜区、2个PKA位点、4个PKC位点和6个N连接糖基化位点,并且在跨膜区9和10间存在一个大胞外环。利用Western blot分析了奶牛bPepTl的胃肠道组织分布规律,发现空肠和回肠的bPepT1蛋白表达量显著高于其他部位(P<0.05),表达量最低的部位为瘤胃,奶牛bPepT1蛋白表达量从高到低依次为：空肠>回肠>十二指肠>瓣胃>瘤胃,说明奶牛空肠和回肠可能具有较前胃更强的小肽转运能力。另外,将真核表达载体pcDNA3.1/bPepTl转染到中国仓鼠卵母(CHO)细胞内,并成功表达了bPepTl基因和功能,转染的CHO细胞对0.02 mM同位素标记的[3H]-Gly-Sar的摄取在10 min时达到饱和,并存在pH依赖性,最佳摄取pH为6.5-7.0(pH梯度为：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)；存在浓度依赖性(浓度梯度为：0.02-10 mM),米氏常数Km(代表亲和力)为0.94±0.06 mM,最大转运速率Vmax为20.80±1.74 nmol/(mg protein·5 min),属于低亲和力高容量载体。通过检测其他16种含Met和Lys等EAA的小肽的IC50(抑制[3H]-Gly-Sar吸收量一半时所需要抑制肽的浓度,IC50越大表示亲和力越小),发现bPepTl对不同小肽的亲和力不同,其中11种小肽的IC50在0.014-0.096 mM之间(Trp-Phe. Met-Lys、Met-Glu、Gly-Met、Lys-Met、Met-Gly、Gly-Lys、Met-Leu、Lys-Phe、 Met-Met和Met-Leu-Phe),说明bPepTl对这些小肽有很高的亲和力；另外4种小肽(Lys-Lys、Leu-Gly-Gly、Lys-Trp-Lys和Met-Gly-Met-Met)的IC50大于2.069mM,说明它们不易被bPepT1转运,其中Lys-Lys几乎不被转运(IC50大于10mM)；此外,在FAA存在时并没有抑制现象。总之,本试验是初次系统研究奶牛bPepT1的表达功能特点,并发现bPepT1可广泛转运二肽和三肽,对C端含Lys的肽、含正电荷的肽、长链肽不易转运,并具有种属特异性。综上所述,本文成功建立了体外研究奶牛小肽吸收的OEC培养模型,发现bPepT1在OEC吸收小肽过程中发挥了重要作用,并且奶牛PepT1可广泛转运二肽和三肽,且有种属特异性。