紫丁香叶治疗金黄色葡萄球菌子宫内膜炎的活性成分及作用机制研究

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子宫内膜炎是生猪养殖中常见的疾病,其会增加母猪淘汰率和非生产天数,导致母猪发热、采食量下降以及猪只消瘦,甚至会引发继发感染导致败血症,造成猪只死亡。目前多采用消毒剂和抗菌药物治疗母猪子宫内膜炎,但长期过度滥用及不规范使用往往加剧致病菌耐药性的产生,达不到预期治疗效果。而与消毒剂和抗菌药物相比,中药具有低毒性、副作用小、低残留等优势,并可通过“多活性成分、多靶点、多作用通路”来发挥作用。因此,开发治疗母猪子宫内膜炎新型中兽药,并阐明其作用机制具有重要意义。本研究首先运用网络药理学对紫丁香治疗子宫内膜炎的有效成分及作用靶点进行预测;同时采用超声辅助低共熔溶剂的绿色提取方法提取紫丁香叶的活性成分,并用LC-MS和HPLC方法对紫丁香叶提取物的成分进行定性及定量分析;最后,在成功构建小鼠子宫内膜炎模型的基础上,阐明紫丁香叶及其活性成分对小鼠子宫的病理组织学变化及对TLR/NF-κB信号通路关键基因TLR2、TLR4、IκBα、NF-κB、IL-1β、TNF-α和IL-6表达的调控及蛋白含量变化,探究其作用机制。具体研究结果如下:(1)利用网络药理学对紫丁香成分靶点及子宫内膜炎靶点进行检索与预测,同时通过Cytoscape3.6.1构建“成分-靶点-子宫内膜炎”网络并进行拓扑分析,结果表明:紫丁香成分共有相关靶点254个;子宫内膜炎共有相关靶点90个;紫丁香成分与子宫内膜炎共有28个交集靶点;其中,木犀草素、山奈酚、齐墩果酸和芦丁可能是紫丁香发挥抗子宫内膜炎的主要有效成分。(2)利用String数据库对紫丁香治疗子宫内膜炎的关键靶点进行蛋白-蛋白互作(Proteinprotein interaction,PPI)预测并对PPI网络进行分析,利用DAVID数据库对关键靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,结果表明:PPI网络核心靶点蛋白分别为TNF、IL-6、IL-8和IL-10;GO注释共得到37个条目;KEGG富集共得到43条信号通路。(3)利用超声辅助低共熔溶剂法对紫丁香叶活性成分进行绿色提取,LC-MS法对提取物进行定性分析,D101大孔树脂对提取物的目标成分进行富集,通过HPLC法对有效成分进行定量分析。结果表明:经LC-MS法共鉴定出山奈酚、芦丁、木犀草素、金丝桃苷、齐墩果酸、槲皮素、异槲皮素和咖啡酸等8种主要成分;网络药理学预测中的前四种活性成分被成功提取并富集,主要成分木犀草素、山奈酚、齐墩果酸和芦丁含量分别为7.98±0.03 mg/g、41.57±0.07μg/g、485.70±0.12μg/g和10.00±0.16 mg/g。(4)构建金黄色葡萄球菌诱导的小鼠子宫内膜炎模型,通过H&E染色观察不同组别小鼠子宫的病理组织学变化。结果表明:空白组及0.5%CMC-Na溶剂对照组小鼠子宫结构完整;模型组出现严重的病理改变,包括子宫内膜充血水肿,大量炎症细胞浸润,腺体数量减少;各给药组在不同程度上改善由金黄色葡萄球菌引起的子宫组织损伤。(5)利用荧光定量PCR法和ELISA法测定紫丁香叶及4种有效成分对小鼠子宫中TLR2、TLR4、IκBα、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA的表达情况及蛋白含量变化。结果表明:与空白组相比,模型组小鼠子宫组织中的TLR2、TLR4、IκBα、NF-κB、IL-1β、TNF-α和IL-6的表达量和蛋白含量均显著升高;相比于模型组,紫丁香叶提取物及其4种有效成分给药组小鼠子宫组织中的TLR2、TLR4、IκBα、NF-κB、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平和蛋白含量显著下降。综上所述,本研究通过网络药理学手段预测了紫丁香治疗子宫内膜炎的潜在活性成分和分子机制,发现紫丁香叶可以通过“多活性成分、多靶点、多作用通路”的方式发挥作用;通过超声辅助低共熔溶剂法对紫丁香叶活性成分进行绿色提取;在成功构建小鼠子宫内膜炎模型的基础上,探究紫丁香叶及其有效成分可通过调控TLRs/NF-κB信号通路影响子宫内膜炎,降低子宫内膜炎小鼠子宫损伤。本研究将为深入开发紫丁香叶治疗母猪子宫内膜炎新型中兽药奠定基础,并为实现中兽药活性成分绿色高效提取提供研究思路。
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