C肽(C-Peptide,CP)是胰岛素A链与B链之间的连接肽，近年来研究发现CP通过与细胞膜上G蛋白耦联的受体结合，使Ca2+通道开放，激活Na+-K+-ATP酶活性和一氧化氮合酶的活性，增加血流量，扩张血管，从而改善糖尿病患者的肾脏、神经、微血管病变。为了加快CP的药物化进展，提高CP在体内的半衰期，我们构建了人血清白蛋白(HSA)-CP融合蛋白，将其在毕赤酵母系统中进行表达，并对表达的融合蛋白进行了鉴定、活性分析和初步的分离纯化。 根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因，PCR从T-CP质粒中扩增CP基因，酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1800bp)和CP(100bp)基因，构建pBlue-HSA-CP质粒。测序结果显示得到的融合基因HSA-CP序列与预期一致。用EcoRI和NotI双酶切重组质粒pBlue-HSA-CP，回收HSA-CP片段，插入分泌表达载体。pPIC9k中，构建表达载体pPIC9k-HSA-CP。表达载体pPIC9k-HSA-CP经限制性内切酶分析和PCR验证表明，融合基因已经成功的插入到载体pPIC9k中。 表达载体pPIC9k-HSA-CP经SalI线性化后电击转化毕赤酵母GS115，用MM和MD平板筛选Mut+转化子，PCR鉴定后，用甲醇诱导摇瓶分泌表达。将表达量较高的重组子进行表达产物鉴定和活性分析，优化诱导时间和诱导剂浓度后，对融合蛋白进行初步的分离纯化。经G418筛选得到能耐受3mg/mLG418重组菌8株，进一步摇瓶诱导筛选得到两株表达量120mg/L的重组菌rHC1，rHC2。优化摇瓶培养条件后，重组菌表达量由120mg/L提高到140mg/L。Westernblot鉴定显示表达的融合蛋白具有HSA和CP的抗原性，为HSA和CP的杂合分子，分子量约为70kDa。细胞活性研究表明HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用。