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α冠状病毒(Alphacoronavirus,α-CoV)成员众多,主要包括人冠状病毒229E(Human Coronavirus 229E,HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(Human Coronavirus NL63,HCoV-NL63)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)、猪呼吸道冠状病毒(Porcine despiratory coronavirus,PRCV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。它们能够引起人和动物的呼吸道、消化道、肝脏以及神经系统疾病,对人类生命财产安全造成严重危害。非结构蛋白1(Nonstructure protein 1,nsp1)是冠状病毒编码的多聚蛋白(Polyprotein,pp)pp1a最N端的组分,仅在α-CoV和β冠状病毒(Betacoronavirus,β-CoV)编码,目前对β-CoV nsp1的研究比较深入。β-CoV nsp1能够通过抑制宿主蛋白合成,减少细胞因子和抗原递呈分子的表达,进而降低机体对病毒感染细胞的杀伤作用,是一个重要毒力因子。目前α-CoV nsp1对病毒毒力的影响及抑制宿主蛋白合成的详细机制都不清楚。本课题以α-CoV nsp1蛋白为研究对象,探索了nsp1蛋白抑制宿主基因表达的结构基础和分子机制,具体内容如下:1.经过分子克隆,蛋白的表达及纯化,晶体的初筛及优化,数据的收集及处理等过程,首次成功解析了四种α-CoVs(PEDV、TGEV、FIPV和SADS-CoV)nsp1蛋白的全长高分辨率晶体结构,显示α-CoV nsp1具有保守的二级结构,主要由两个α-螺旋和六个β-折叠组成。基于α-CoV nsp1的氨基酸(Amino acide,aa)序列和晶体结构,把α-CoV分为两类:一类包括SADS-CoV、PEDV、HCoV-NL63和HCoV-229E,另一类包括FIPV、TGEV和PRCV。2.虽然α-CoV nsp1和β-CoV nsp1的氨基酸序列同源性低,但它们的三级结构同源性高,进而推测α-CoV nsp1跟β-CoV nsp1有相似的生物功能。通过核糖嘌呤霉素化(Ribopuromycylation,RP)及海参荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc)实验,证实了α-CoV nsp1蛋白不仅能够显著抑制海参荧光素酶基因的表达,更能广谱的抑制宿主基因的合成,且呈现时间和浓度依赖性。基于PEDV nsp1的晶体结构,构建一系列截短和突变的质粒,Rluc实验结果表明PEDV nsp1的三段loops(67-71 aa,78-85 aa,103-110 aa)形成抑制宿主基因表达的关键功能域,但这在其它的α-CoV nsp1中并不保守。于是以TGEV nsp1为研究模型,并结合晶体结构和生化实验,最终证实了Motif(91-95 aa)是TGEV nsp1发挥功能的关键区域,更有意义的是这段区域在其它α-CoV nsp1中也有重要作用。3.为验证这段重要区域对病毒的影响,利用CRISPR-Cas9技术成功构建了相应的TGEV突变体。通过对重组毒在细胞和动物水平上的研究,发现了nsp1这段重要区域的突变虽然不会影响病毒在易感细胞上的复制能力,但会显著的降低病毒在易感动物上的致病力,从而首次证实了nsp1是α-CoV的一个关键毒力因子。结合对两类α-CoV nsp1作用于哺乳动物细胞的RNA测序及生化实验的结果证实α-CoV nsp1能影响宿主的免疫逃避和细胞周期,从而达到增强病毒毒力的可能。本课题首次成功解析了四种α-CoVs nsp1蛋白的全长晶体结构,确定nsp1蛋白调控宿主蛋白合成的重要功能区域,阐明nsp1蛋白在病毒毒力方面的关键作用,从而深入诠释α-CoV nsp1蛋白与宿主相互博弈的分子机制,为α-CoV新型疫苗的研制奠定科学基础。