研究背景：临床上,由肿瘤切除、创伤、先天性骨关节病、骨感染性疾病和骨关节炎等原因所致的大节段骨缺损十分常见且修复困难,通过组织工程学技术将种子细胞MSCs (mesenchymal stem cells,间充质干细胞)接种于三维立体支架构建的组织工程骨在大节段骨缺损治疗中的安全性和有效性已经被证实,组织工程骨成为目前修复大节段骨缺损最有希望的策略之一。种子细胞MSCs在组织工程骨的成骨修复过程中发挥重要作用,但具体作用机制不详,严重制约了组织工程骨的应用和发展。骨缺损的修复由早期炎症反应启动,此过程释放大量趋化因子和炎症介质,诱导内源性成骨前体细胞向组织损伤部位迁移。组织工程和再生医学最近的研究表明MSCs可能通过募集宿主成骨相关细胞的间接方式促进骨缺损修复。在体外培养过程中,MSCs可自发分泌多种与细胞迁移密切相关的趋化因子,其表面同时表达多种趋化因子受体。基于此,我们提出MSCs促进成骨修复的可能机制：在组织工程骨修复骨缺损的早期,局部创伤产生的炎症微环境刺激了种子细胞MSCs,MSCs通过分泌多种趋化因子和细胞因子,如SDF-1(stromal cell-derived factor-1,基质细胞衍生因子1)、MCP-1(monocyte chemotactic protein-1,单核细胞趋化蛋白1)等,募集宿主的成骨相关细胞迁移至骨缺损部位促进成骨修复。研究目的：(1)分离、培养hBMSCs (human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,人骨髓来源间充质干细胞)和mBMSCs (mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells,小鼠骨髓来源间充质干细胞),作为研究对象和实验材料。(2)体外模拟炎症微环境,观察其对hBMSCs分泌表达谱及其募集宿主hBMSCs能力的影响,筛选在种子细胞募集宿主hBMSCs过程中发挥重要作用的趋化因子。(3)以mBMSCs为种子细胞复合pDBM (partially decalcified bone matrix,部分脱钙骨基质)支架构建组织工程骨,构建稳定、可重复性好、适用于骨组织工程基础研究的小鼠双侧临界股骨缺损模型,组织工程骨移植骨缺损后评价组织工程骨的成骨修复效果,比较最终的新生骨组织中外源性和宿主内源性细胞所占比例。(4)组织工程骨移植小鼠股骨缺损,观察宿主细胞募集情况,明确募集的宿主细胞种类,初步探索种子细胞募集宿主细胞的作用机制。研究方法：(1)采用密度梯度离心结合贴壁的方法分离培养hBMSCs,采用全骨髓细胞贴壁的方法分离培养mBMSCs, hBMSCs和mBMSCs均通过细胞形态、细胞表面的抗原标志物和多向分化潜能鉴定。(2)在体外向培养基中加入IL-1β(interleukin-1β,白介素1β)、IL-6和TNF-α (tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子α)模拟炎症微环境并刺激hBMSCs,收集条件培养基,通过Transwell迁移实验检测不同的条件培养基对hBMSCs的募集作用,通过半定量和定量的细胞因子抗体芯片筛选在宿主hBMSCs募集过程中发挥重要作用的趋化因子。(3)采用双面静置接种法,以野生型mBMSCs作为种子细胞复合pDBM支架构建组织工程骨,环境扫描电镜观察确认构建结果；以GFP (green fluorescent protein,绿色荧光蛋白)+转基因小鼠为受体,利用本课题组自行设计的小鼠股骨内固定钢板制备双侧股骨临界骨缺损模型；左右两侧股骨缺损分别移植组织工程骨和pDBM支架,术后通过Micro-CT、HE (hematoxylin-eosin,苏木精伊红)染色和检测OCN (osteocalcin,骨钙素)mRNA表达量比较组织工程骨与pDBM支架的成骨修复效果；通过激光共聚焦显微镜扫描、计算、比较新生骨组织中外源性和内源性细胞比例。(4)移植术后不同时相点取双侧股骨或移植物,通过小动物活体成像系统初步观察宿主细胞募集情况,制备组织切片,通过病理染色及细胞计数评价种子细胞对宿主细胞的募集作用,通过免疫荧光染色明确募集的宿主细胞种类；移植术后不同时相点取双侧股骨或移植物,通过RT-PCR比较组织工程骨和pDBM支架内SDF-1、CXCR4 (C-X-C motif chemokine receptor-4, CXC类趋化因子受体4)、MCP-1、CCR2(C-C motif chemokine receptor-2,CC类趋化因子受体2)、CD34、CD14和CD31 mRNA表达量的差异,初步探索种子细胞募集宿主细胞的作用机制。研究结果：(1)采用密度梯度离心结合细胞贴壁法分离的第四代人骨髓间充质干细胞,镜下可见成纤维细胞样细胞贴壁生长,呈长梭形,形态均一；流式细胞检测细胞表型显示：MSCs抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105高表达；造血系抗原CD34、CD45和内皮细胞系抗原CD31低表达；诱导分化的第四代细胞经茜素红染色和油红O染色证实具有成骨和成脂分化潜能。采用全骨髓细胞贴壁的方法分离培养的第四代小鼠骨髓间充质干细胞,具有均一的成纤维细胞形态,呈漩涡状生长；流式细胞检测细胞表型显示：MSCs抗原CD73、CD90和CD105阳性：造血系抗原CD45以及内皮细胞系抗原CD31均为阴性；特殊病理染色证实第四代细胞具有成骨、成脂分化能力。(2)未经炎症微环境刺激的hBMSCs的条件培养基募集宿主hBMSCs的能力显著强于空白培养基,略高于包含有前炎症因子的炎性培养基；经炎性处理的hBSMCs募集hBMSCs的能力显著强于未经炎症微环境刺激的hBMSCs;半定量细胞因子抗体芯片结果显示hBMSCs经炎症微环境刺激后,11种趋化因子的表达量显著增加,包括CXCL16(CXC chemokine ligand 16, CXC趋化因子配体16)、骨保护素、GRO(growth-regulated oncogene,生长调节致癌基因)、ENA78(epithelial neutrophil-activating peptide-78,上皮细胞来源的中性粒细胞活化肽78)、MIP-1δ(monocyte chemoattractant protein-1δ,巨噬细胞炎性蛋白1δ)、MCP-1、MCP-2、MCP-3、GCP-2(granulocyte chemotactic protein-2,粒细胞趋化蛋白2)、IL-6和IL-2Ra(interleukin-2 receptor a,白介素2受体α)。定量细胞因子抗体芯片进一步证实炎症微环境可刺激hBMSCs分泌更多的趋化因子,其中21种趋化因子表达量显著增加。(3)采用双面静置接种法构建的组织工程骨细胞上架率高,扫描电镜观察结果显示接种后第10天,细胞紧密粘附于支架材料内表面生长,并分泌大量的细胞外基质；利用本课题组自行设计的小鼠股骨内固定钢板构建的双侧临界骨缺损模型手术时间短,术后动物很快恢复日常活动；钼靶X线证实建模成功,组织工程骨成骨修复效果显著优于对照的pDBM支架,Micro-CT, HE染色和OCN表达量测定的结果进一步证实了此现象；利用GFP+转基因小鼠,我们发现在组织工程骨介导的新生骨组织中,宿主细胞的贡献比例约为90.42%,远高于外源性细胞。(4)小动物活体成像系统观察显示组织工程骨和pDBM支架区荧光强度随时间增加,在术后第7天和第10天,组织工程骨内荧光强度显著高于pDBM支架。激光共聚焦显微镜观察结果证实术后第7天,组织工程骨内宿主细胞数量显著多于pDBM支架内细胞数量,此差异在术后第10天仍然存在。免疫荧光染色结果显示,移植术后组织工程骨内CD73+和CD90+宿主细胞数量均随时间延长而增加,且组织工程骨内CD73+和CD90+宿主细胞数量显著多于pDBM支架内细胞数量；移植术后第3天,组织工程骨内CD14+宿主细胞数量相比术后第1天有所减少,且少于pDBM支架内细胞数量,术后第7天,组织工程骨内出现大量CD14+宿主细胞,其数量显著高于pDBM支架内细胞数量,此差异在术后第10天仍然存在；移植术后,组织工程骨内CD31+宿主细胞数量显著多于pDBM支架内细胞数量,组织工程骨内CD31+宿主细胞数量在术后第10天达到最大值,之后逐渐减少。进一步的RT-PCR (real-time polymerase chain reaction,实时定量荧光多聚酶链反应)结果显示,移植术后第7天和第10天,组织工程骨内SDF-1和CXCR4 mRNA表达水平均显著高于pDBM支架,与之一致的是CD34 mRNA表达量的差异；移植术后第7天,组织工程骨内MCP-1、CCR2和CD 14 mRNA表达水平显著高于pDBM支架,术后第10天,组织工程骨内MCP-1和CD 14 mRNA表达水平仍显著高于pDBM支架。研究结论：(1)采用密度梯度离心结合细胞贴壁法和全骨髓细胞贴壁法分别分离培养的人和小鼠骨髓间充质干细胞具有成纤维样细胞形态,体外增殖能力强,具有多向分化潜能,表达多种间充质干细胞表面抗原标志物,可以作为本研究的研究对象和实验材料；(2)在体外培养过程中,hBMSCs可自发分泌多种细胞因子,这些因子可促进宿主hBMSCs的迁移；炎症微环境的刺激可显著增强hBMSCs分泌趋化因子的能力,进而增强hBMSCs募集宿主hBMSCs的能力；在炎症微环境刺激hBMSCs分泌的众多趋化因子中,GRO表达量最高,可能在一定程度上影响宿主hBMSCs的迁移；(3)采用双面静置接种法构建的组织工程骨满足本研究的要求；构建的小鼠双侧股骨临界骨缺损模型稳定、可重复性好,支持影像学、分子生物学、组织形态学等检测手段,适用于骨组织工程基础研究应用；组织工程骨修复骨缺损效果显著优于空白支架,说明种子细胞在成骨修复过程中发挥重要作用,但最终的新生骨中外源性细胞所占比例很低,新骨形成主要依赖于宿主来源成骨相关细胞的贡献。(4)在骨缺损修复早期炎症反应阶段,组织工程骨内MSCs可募集更多的宿主细胞至骨缺损处促进成骨修复,募集的宿主细胞种类包括MSCs,单核细胞和内皮祖细胞,SDF-1/CXCR4和MCP-1/CCR2两条轴在宿主细胞的募集过程中发挥重要作用。