第一部分miR-92在HPV16阳性的宫颈鳞癌组织及细胞中的表达　　 目的：　　 miR-17-92基因簇由于参与哺乳动物多个器官发育并与多种实体肿瘤的发生密切相关而受到广泛关注。miR-17-92基因簇位于人染色体13q31.3处，C13orf25基因含子区，最终可产生miR-17，miR-18，miR-19a，miR-20，miR-19b和miR-92等六个成熟的miRNA。miR-92在宫颈癌中的表达、功能及机制尚不清楚。本研究检测miR-92在宫颈鳞癌标本及细胞中的表达，初步探讨miR-92异常表达与宫颈鳞癌发生的关系。　　 方法：　　 采用qRT-PCR法检测新鲜宫颈鳞癌组织与正常宫颈组织中miR-92表达量的差异。通过免疫组化方法确认组织中HPV16表达情况，将宫颈癌组织分为HPV16阳性组与阴性组，比较HPV16对miR-92表达量的影响。进而采用qRT-PCR法检测宫颈鳞癌细胞SiHa及C33A细胞株中miR-92表达量的差异。　　 结果：　　 34例宫颈癌组织中23例HPV16(+)，11例HPV16(-)。34例宫颈癌组织中miR-92的表达明显高于34例正常宫颈组织，是正常宫颈组织的5.56倍(p＜0.05)。23例HPV16(+)宫颈癌组织中miR-92的表达量是HPV16（-）组织的3.56倍(p＜0.05)。在SiHa细胞中miR-92表达量是C33A细胞的3.79倍(p＜0.05)　　 结论：　　 1、miR-92在宫颈鳞织中高表达。　　 2、HPV16病毒影响miR-92的表达。　　 第二部分miR-92调控宫颈鳞癌细胞生物学功能的研究　　 目的：　　 越来越多的miRNA被发现参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等多种生命过程，因此我们在体外细胞中模拟细胞在体能的生命过程。通过改变miR-92在宫颈鳞癌细胞中的表达，探讨miR-92调控宫颈鳞癌细胞增殖、迁移、凋亡的机制。此外我们模拟人体内环境，改变miR-92表达后对肿瘤生长的影响，并对体外实验结果进一步验证。　　 方法：　　 向宫颈鳞癌SiHa细胞中转染miR-92-mimic与miR-92-inhibitor，改变SiHa细胞中miR-92表达。以荧光显微镜观察转染效率，以qRT-PCR检测转染后miR-92升高或抑制效率。细胞转染后应用CCK-8法检测细胞的增殖能力，Transwell法检测细胞迁移能力，Tunel法检测细胞凋亡情况。Western blot法检测转染后细胞PTEN的表达情况。在裸鼠前肢腋下皮下接种转染后的SiHa细胞与未转染的SiHa细胞，每3天观察成瘤情况，裸鼠体重等。5周后处死，石蜡包埋，切片，HE染色检测肿瘤来源。TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。　　 结果：　　 转染miR-92-mimic后可有效增加细胞中miR-92的表达。转染miR-92-inhibitor可有效抑制细胞miR-92的表达。抑制miR-92的表达后，SiHa细胞增殖、迁移、侵袭能力降低，细胞凋亡增加(p＜0.05)。转染miR-92-mimic后细胞中PTEN蛋白表达降低，抑制细胞中miR-92的表达后PTEN蛋白升高。抑制miR-92表达后，SiHa细胞成瘤性降低，肿瘤体积减小，成瘤时间长，成瘤数目少，细胞凋亡数目增加。与为转染组比较瘤体组织结构无明显差异。　　 结论：　　 1、增加或抑制宫颈鳞癌Siha细胞中miR-92的表达，可改变细胞的增殖能力。　　 2、抑制宫颈鳞癌Siha细胞中miR-92表达后，凋亡增加。　　 3、miR-92影响宫颈鳞癌Siha细胞的细胞迁移。　　 4、miR-92可影响PTEN蛋白的表达。　　 5、抑制宫颈鳞癌Siha细胞中miR-92表达后，可明显抑制SiHa细胞成瘤能力，细胞凋亡增加。　　 第三部分HPV16 E6基因对miR-92表达的影响　　 目的：　　 高危型人乳头状瘤病毒(HPV)，尤其是HPV16型，在宫颈癌发生、发展进稗中起关键作用。文章第一部分我们HPV16会影响miR-92的表达，但具体是何种因素干扰尚不清楚。在HPV16病毒感染早期，E6基因是导致宫颈上皮细胞恶性转化和永生化的重要因素之一。而E6基因是否会对miR-92的表达产生影响尚不清楚。在本章中将初步探讨HPV16E6基因对miR-92表达的影响。　　 方法：　　 建立HPV16E6稳定表达的C33A细胞系，western blot方法检测E6蛋白表达。E6siRNA干扰SiHa及C33A-pEGFP-N1-E6细胞中E6表达，western blot法检测干扰效率。qRT-PCR法检测转染前后C33A细胞中miR-92的表达情况，及E6干扰前后SiHa及C33A-pEGFP-N1-E6细胞中miR-92的表达情况。　　 结果：　　 荧光显微镜下观察转染pEGFP-N1-E6的C33A细胞及同一视野的普通光源结果，可见85％以上的细胞可见荧光，转染效率较高。转染后C33A-pEGFP-N1-E6细胞中E6蛋白的表达明显增加。SiHa及C33A-pEGFP-N1-E6细胞转染E6siRNA后，两种细胞中E6蛋白的表达均降低。转染pEGFP-N1-E6后C33A细胞中miR-92的表达相对于未转染组细胞高表达。转染E6siRNA后SiHa及C33A-pEGFP-N1-E6细胞中miR-92的表达相对于未干扰组相对低表达。相对于未干扰组C33A-pEGFP-N1-E6细胞miR-92的表达在转染后的细胞中相对低表达。　　 结论：　　 1、E6可影响miR-92在宫颈癌细胞中的表达。