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背景:T细胞受体工程化T细胞（T cell receptor engineered T Cell,TCR-T）疗法是肿瘤治疗中一种新兴免疫治疗方法。TCR-T疗法为人类癌症的治疗带来了巨大的希望。TCR-T细胞治疗是将具有功能性的TCR通过基因工程编辑导入到T细胞再回输到体内达到抗肿瘤的作用。体外TCR-T细胞制备工艺影响回输治疗的疗效。同时,体外TCR-T细胞质量优化需要考虑TCR转染率、T细胞回输后在体内持久性等方面问题。因此,优化TCR-T细胞制备质量及建立评价体系对提高T细胞抗肿瘤作用具有重要意义。TCR的结构是由一条α链和一条β链组成的异源二聚体。在TCR-T细胞制备过程,外源引入的TCRα/β链与T细胞表达的内源性TCRα/β链可能发生配对。TCR错配降低了转导的TCR的表面表达,而且错配的TCR与正确配对的TCR竞争性地与有限的CD3分子结合。此外,错配TCR没有经过胸腺选择,可能对自身抗原具有特异性。因此,TCR的正确配对程度直接影响后期TCR-T细胞治疗疗效和临床应用安全性。另一方面,TCR转导T细胞的效率是TCR-T细胞制备的重要质控指标之一。目前通常使用含VSV-G的慢病毒载体（lentiviral vectors,LVVs）作为转导质粒。为了提高TCR转染效率,通常通过CD3和CD28抗体或CD3/CD28-Dynabeads活化T细胞。目前在T细胞活化后CD137等作为活化标志分子。虽然这些分子能够代表T细胞的活化程度,但是并不能评价活化后T细胞的TCR转染率。同时,TCR-T细胞扩增周期较长,所以在制备细胞早期寻找有效的标志分子评价TCR转染率,对预估TCR-T细胞质量具有重要意义。T细胞回输后在体内持久性是影响T细胞疗效重要因素。在接受抗原刺激后T细胞的分化从TN分化成具有干性特征的TCM,这类细胞相较于效应T细胞（TE）在体内具有较长的持久性。因此,获得低分化的TN和TCM细胞表型是提高TCR-T细胞质量的另一重要因素。然而,TCR-T细胞表型状态受到制备过程中的活化方式的影响。选用何种活化方式以及活化条件,直接影响制备的TCR-T细胞感染率和对应的细胞亚型。目的:为了提高TCR-T细胞制备质量和建立质控评价方法,本研究拟通过TCR恒定区改造,降低TCR错配提高TCR表达,优化TCR-T细胞的制备。其次,通过活化后T细胞表面LDL-R表达作为指标,优化T细胞活化方法,建立早期评估TCR-T细胞质量的方法。方法:1.在TCR恒定区结构改造方面,我们通过重叠PCR和定点突变等基因工程方法,分别构建了鼠源恒定序列替换（m KT2）、二硫键（h KT2-S）、二硫键联合恒定区域交换（h KT2-S-C）、二硫键联合跨膜疏水突变（h KT2-S-αLVL）、二硫键联合恒定区域交换及跨膜疏水突变（h KT2-S-C-αLVL）这5种恒定区改造TCR,以减少TCR转导的错配率。2.将5种恒定区改造TCR构建慢病毒载体,通过慢病毒转导到Jurkat细胞和T细胞,制备相应的TCR-Jurkat细胞株和TCR-T细胞株,通过特异性Tetramer染色,流式检测外源TCR,以评价TCR的表达。3.将构建的TCR-Jurkat细胞株与实验室前期构建的抗原提呈细胞K562-A11:01共培养,同时给予外源特异性多肽抗原KRAS G12V刺激,分别通过流式细胞术检测其饱和浓度、滴定浓度（0.1 n M-10μM）抗原肽条件下的CD69表达;4.上述同样的共培养条件下,将h KT2-S-αLVL组和m KT2组TCR-T细胞株作为效应细胞,16 h后流式检测CD137表达,24 h后Elisa检测上清中IFN-γ分泌,并且检测24 h后上清中LDH的水平以分析其外源肽靶向杀伤能力。5.分别设置不同使用量和不同时间的CD3/CD28-Dynabeads活化T细胞,通过流式细胞术检测活化后T细胞的LDL-R表达水平;将活化后T细胞转染鼠源化改造的TCR（m TCR）,通过流式细胞术检测m TCR转染率。6.通过流式细胞术检测CCR7和CD45RA表达情况,分析活化前T细胞的亚型分布;通过流式检测CD3/CD28-Dynabeads活化不同时间下各个亚型T细胞的LDL-R表达水平。以1:1使用量CD3/CD28-Dynabeads活化T细胞24 h,转染m TCR制备TCR-T细胞,扩增14天后,通过流式细胞术检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的占比;通过流式检测,分析各亚型细胞中m TCR+CD8+T细胞占比。7.将CD3/CD28-Dynabeads活化方法与成本较低活化方法OKT3进行比较,流式检测两种活化方法下CD4+T细胞和CD8+T细胞表面LDL-R的表达情况;两种方法活化T细胞后分别转染m TCR,并通过流式检测其转染率。8.分别采用CD3/CD28-Dynabeads和OKT3活化T细胞,制备m TCR-T细胞,扩增14天后,通过流式检测T细胞亚型分化情况;为了逆转CD3/CD28-Dynabeads过度活化导致T细胞向耗竭表型分化,我们尝试通过在感染24 h后移除CD3/CD28-Dynabeads,流式检测去除CD3/CD28-Dynabeads与否TCR+CD3+T细胞群的亚型占比,着重观察了m TCR+CD8+T细胞群的亚型占比情况。结果:1.我们分别设计了5种恒定区改造TCR的结构,并构建了相应的Pwpxl表达载体,该载体以EF-1α为启动子,联合包装载体p MD2.G和p SPAX2,制备慢病毒。2.以鼠源化恒定区替换改造（m KT2）为对照,二硫键（h KT2-S）、二硫键联合恒定区域交换（h KT2-S-C）、二硫键联合跨膜疏水突变（h KT2-S-αLVL）、二硫键联合恒定区域交换及跨膜疏水突变（h KT2-S-C-αLVL）这4种不引入外源序列的恒定区结构改造方案中,二硫键联合跨膜疏水突变（h KT2-S-αLVL）组的CD8+Tetramer+Jurkat细胞占比显著较高,达90%以上;转导T细胞时趋势一致,h KT2-S-αLVL组的表达阳性率倾向于较高。3.检测在饱和浓度外源肽条件下几种人源恒定区改造TCR的CD69表达,我们发现与h KT2-S、h KT2-S-C以及对照组m KT2相比,h KT2-S-αLVL组的CD69+Jurkat细胞占比显著较高,也倾向于高于h KT2-S-C-αLVL。在滴定的多肽浓度（0.1 n M-10μM）条件下,5种恒定区改造CD69表达的EC50值均在10 n M-70 n M范围内,无显著差异。4.对h KT2-S-αLVL TCR转导构建的TCR-T细胞进行验证,结果发现h KT2-S-αLVL显示出与m KT2相当的饱和浓度（10μM）抗原肽下CD137表达。在滴定的多肽浓度（0.01 n M-10μM）下h KT2-S-αLVL与对照组m KT2相比CD137表达的EC50值相差不大,IFN-γ分泌情况相当;h KT2-S-αLVL与m KT2的外源肽靶向杀伤细胞能力相当。5.无论是CD8+T还是CD4+T细胞群,CD3/CD28-Dynabeads使用量为1:1和2:1时,LDL-R表达均显著高于使用量0.5:1;对于CD8+T细胞群,使用量1:1和2:1时,TCR-T细胞的感染率均可达到55%左右,CD8+T细胞群感染率高于使用量0.5:1组（45%左右）;对于CD4+T细胞群,使用量为0.5:1、1:1和2:1时感染率均可达55%左右,无差异。这些结果表明,三组细胞中CD8+T细胞群感染率与LDL-R表达水平相一致。6.CD3/CD28-Dynabeads活化24 h时,CD8+和CD4+T细胞LDL-R表达水平均达到高峰,且CD8+T细胞组持续至48 h;CD4+T细胞随着时间延长有下降的趋势。然后,使用1:1使用量的CD3/CD28-Dynabeads活化T细胞24 h或48 h,转染m TCR后检测m TCR+T细胞占比,CD8+和CD4+T细胞亚群感染率均无显著差异。7.活化前PBMC中以TN和TCM占比为主,达到70%以上,而各亚型T细胞对应的LDL-R几乎无表达;24 h和48 h CD3/CD28-Dynabeads活化组T细胞各亚群LDL-R显著高于活化前对照组;而24 h活化组TN和TCM中LDL-R显著高于表达48 h组。进一步,按照上述建立的优化方法,CD3/CD28-Dynabeads活化T细胞后制备TCR-T细胞,并扩增14天后,以CD8+T细胞为主,占比接近80%;同时,我们检测CD8+T细胞中不同亚型的m TCR+T细胞的占比,结果显示TN和TCM占比较高,TE阳性率较低,与活化24h后T细胞LDL-R表达水平一致。8.OKT3活化48 h和CD3/CD28-Dynabeads活化24 h两种活化方式下,T细胞表面LDL-R的表达水平均较高,且两群细胞LDL-R阳性率无明显差异。两种方式活化T细胞后进行慢病毒转导m TCR并检测其感染率,无论是CD8+T细胞还是CD4+T细胞中,CD3/CD28-Dynabeads活化24 h组m TCR-T细胞占比均显著较高于OKT3活化48 h组,转染率均达到了50%以上。9.在CD3+T细胞中,OKT3活化组TN表型明显高于CD3/CD28-Dynabeads活化组,而CD3/CD28-Dynabeads活化组TE表型明显高于OKT3活化组,m TCR+CD8+T细胞的分化亚型与CD3+T细胞中看到结果相似。无论是在CD3+T细胞还是CD8+T细胞,活化感染后去除CD3/CD28-Dynabeads,TN占比显著增高,TE占比显著降低,所获得的TCR-T细胞更偏向于低分化亚型。结论:1.在鼠源恒定序列替换（m KT2）、二硫键（h KT2-S）、二硫键联合恒定区域交换（h KT2-S-C）、二硫键联合跨膜疏水突变（h KT2-S-αLVL）、二硫键联合恒定区域交换及跨膜疏水突变（h KT2-S-C-αLVL）这5种改造策略中,二硫键联合跨膜区疏水突变（h KT2-S-αLVL）改造是一种能够有力增强TCR表达的TCR恒定区结构改造策略,优化了TCR-T细胞制备方法。2.初步建立了一种基于T细胞活化后LDL-R的表达水平检测对TCR-T细胞制备质量的评价方法。