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目的探讨puma基因突变、mRNA及其功能蛋白表达与肺癌的相关性;PUMA与p53的依赖性关系。方法通过对实验条件的探讨,建立了扩增高GC碱基的PCR方法,使GC含量高达82%的模板成功扩增;建立了实时荧光定量RT-PCR检测puma mRNA的方法。应用所建立的方法和免疫印迹法（Western Blot,WB）检测40例肺癌患者的癌组织、癌旁组织和远癌组织及10例肺良性病变组织中DNA和BH3结构域的突变:puma mRNA及其编码蛋白表达的情况;其次,TUNEL检测其中20例肺癌患者的癌组织、癌旁组织和远癌组织的细胞凋亡状态。结果1.通过对实验条件的探讨,确立了puma基因三个外显子的最终扩增条件,分别如下:（1）外显子2（Exon2）的反应体系为dNTP 200μmol/L,MgSO4 3.0mmol/L,引物500nmol/L,TaqDNA聚合酶0.1U/μL,模板量不低于4 000ng,10×缓冲液5μL,增强液10μL,总体积50μL。反应条件为95℃预变性5min,95℃45Sec、64℃45sec、72℃45sec,循环33次,最后72℃延伸5min。（2）外显子3（Exon3）的反应体系MgSO4 2.0mmol/L,外显子4（Exon4）的反应体系MgSO4 1.0mmol/L,其余组分和扩增程序与外显子2相同。2.应用优化后的扩增体系和条件对40例肺癌患者的癌组织,癌旁组织和远癌组织以及10例肺良性病变患者的肺组织的puma基因2、3和4共3个外显子进行了PCR扩增,扩增产物经纯化后测序检测突变及小的删除片段,经Blast 2与GeneBank序列比对,未发现一例外显子突变及小的删除片段,HB3结构域也没有变异。3.通过对实验条件的探讨,检测puma mRNA实时荧光定量RT-PCR反应体系为cDNA 1.0μl,dNTP 800μmol/L,Taq DNA聚合酶5.0 u,Mg2+1.5mmol/L,1×Enhancersolution 5.0μl,10×buffer 5.0μl,引物各500nmol/L,0.5×SYB Green I 1.0μl,总体积50μl。内参基因GAPDH体系中不加1×Enhancer solution,其余成分同上。扩增条件:94℃预变性5min,94℃变性45see,56℃退火45sec,72℃延伸45sec,共40个循环,终末72℃延伸5 min。4.应用所建立的实时荧光定量RT-PCR检测puma mRNA表达的相对量,pumamRNA在癌组织、癌旁组、远癌组及肺良性病变对照组中均有表达,癌组织1.17±0.08、癌旁组织1.16±0.07、远癌组织1.18±0.07、肺良性病变对照组织1.17±0.11。经方差分析,puma mRNA的表达在同一病例的癌组织、癌旁组织和远癌组织之间差异无统计学意义（F=0.416,P＞0.05）,puma mRNA在肺癌组织和肺良性病变的表达量差别无统计学意义（F=0.264,P＞0.05）。而且鳞癌、腺癌及腺鳞癌的癌组织、癌旁组织和远癌组织中puma mRNA水平差异无统计学意义（F=0.311,P＞0.05;F=0.338,P＞0.05:F=0.329,P＞0.05）。5.PUMA蛋白检测显示:癌组织、癌旁组织及远癌组织中的表达量分别为1.30（0.98～1.74）、1.11（0.72～1.69）和1.01（0.71～1.49）;10份肺良性组织标本的均值为1.17±0.11。经秩和检验分析,在同一病例的癌组织、癌旁组织和远癌组织的PUMA蛋白表达差异无统计学意义（x2（H）=4.918,P＞0.05）;PUMA蛋白在肺癌组织和肺良性病变的表达量差别无统计学意义（x2（H）=5.092,P＞0.05）。WB结果还显示鳞癌、腺癌及腺鳞癌的癌组织、癌旁组织和远癌组织中PUMA表达水平差异无统计学意义（F=0.101,P＞0.05;F=0.599,P＞0.05;F=1.054,P＞0.05）,表明PUMA表达水平与肺癌的病理分型无关。6.P53蛋白检测显示:癌组织P53蛋白的表达量与癌旁组织、远癌组织和肺良性病变组织之间,蛋白表达差异有统计学意义,癌旁组织和远癌组织之间差异无统计学意义。7.TUNEL结果显示:癌组织、癌旁组织和远癌组织AI分别是:4.96%±1.63%,1.45%±0.46%和1.26%±0.42%。癌组织的AI高于癌旁组织和远癌组织,AI差异有统计学意义,Z=-0.-3.920,P=0.000;同时癌旁组织与远癌组织之间AI的差异也有统计学意义,Z=-0.-3.469,P=0.001。8.P53与PUMA关系分析:PUMA蛋白表达与P53蛋白表达之间没有直接关系,其可能的原因是由于肺癌患者P53的突变很高,突变的P53失去来对PUMA的调控作用。结论puma在肺癌发生发展过程中基因的结构很稳定,没有发生有意义的突变和BH3结构域的变异;puma mRNA、蛋白表达和细胞凋亡等研究表明,PUMA表达可能不是伴随肺癌发生和发展过程的重要因素;mRNA和蛋白表达水平与肺癌的组织类型无关。P53没有介导PUMA的表达,同时肺癌发生发展的各种因素也没有诱导PUMA的过表达,因此,在肺癌发生发展过程中,细胞凋亡的异常,引起细胞的过度增殖和对放化疗的敏感性减低,导致肺癌一直是全球发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤。本研究结果与体外细胞株的研究结果不一致,而与其他肿瘤组织的研究结果一致,说明PUMA在肿瘤的发生发展中,不同的组织有不同的表现,其在肺癌发生发展中的作用还有待进一步的研究,是否能作为肺癌诊断和治疗的新靶点还有待进一步的研究。