口腔粘膜鳞状细胞癌的发生是一个多因素的过程,角蛋白的表达不仅与部位有关,而且与细胞类型和分化程度有关。角蛋白被证明是发现局部侵袭、微小转移和远处转移非常好的标记物,角蛋白不仅可以对肿瘤早期发现和鉴别诊断,还可以对预后进行评价。目前为止,国内外都还没有对口腔颌面部肿瘤角蛋白谱的具体而详尽的分析工作,目前也还没有国内自主生产和商品化的角蛋白相关单克隆抗体。因此,系统分析研究口腔颌面部鳞状细胞癌角蛋白谱的变化,并且对特异性角蛋白组进行提取分离和鉴定,进行单克隆抗体的制备和筛选,对于进一步探索检测早期癌变、转移病灶乃至生物治疗鳞癌都是极为重要的。 基于以上目的,本实验进行了以下四部分实验的研究。 实验一 舌高分化鳞状细胞癌角蛋白谱的分析 目的:研究口腔舌高分化鳞状细胞癌角蛋白谱的特点。方法:舌高分化鳞状细胞癌及正常舌体组织活检标本,提取角蛋白,进行SDS-PAGE电泳和利用免疫印迹(Western-blot)杂交方法对比研究舌高分化鳞状细胞癌及正常舌体组织中角蛋白谱的表达。结果:舌高分化鳞状细胞癌中出现了单层角蛋白上皮如CK18、19。结论:舌高分化鳞状细胞癌变异性表达的CK18、19和CK10的不表达,是舌癌发生演变过程的结果,舌癌角蛋白谱的变化与肿瘤的变化有密切关系,可以作为研究肿瘤生物学特征的重要指标。 实验二 舌癌角蛋白组的分离和纯化 目的:将舌癌中的角蛋白组提取出来,作为下一步进行单克隆抗体制备的抗原。方法:在利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹(Western-blot)杂交方法确定舌癌组织中角蛋白谱的表达位置后,利用跑大胶的方法大量提取舌癌角蛋白并进行鉴定。结果:成功提取了大量的舌癌角蛋白组群,鉴定后分子量区间符合角蛋白。结论:利用电泳法大量提取了角蛋白,可以作为下一阶段单克隆抗体的抗原使用。 实验三 抗舌癌角蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 目的:用人高分化舌鳞状细胞癌角蛋白组群为抗原,制备了抗舌癌角蛋白单克隆抗体并对单抗的特异性进行鉴定。方法:提取和纯化的舌癌角蛋白免疫小鼠,利用小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术,间接免疫酶标法筛选阳性克隆,抗体分泌检测和亚克隆,建立了五株稳定分泌抗舌癌角蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行抗角蛋白单克隆抗体的亚类及特异性鉴定。结果:融合细胞共384孔,融合率95%,共获得5株抗角蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,用终末稀释法克降化三次,阳性率达100%,分别命名为Lck1-5,IgG亚类测定属