背景：骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是指骨髓中一群具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、肌腱细胞等多种细胞分化潜能的多能干细胞。由于其取材容易、在体外易分离和扩增培养，在长期培养过程中，始终保持其多向分化潜能，遗传背景稳定，自体移植可避免免疫排斥反应，是组织工程学和创伤愈合研究中的理想种子细胞，在医学领域具有广泛的应用前景。在最近几年内，一系列令人振奋的研究报道突破了传统认为MSC不能跨胚层分化的观点，拓宽了MSC向三个胚层的分化潜能。本研究就MSC能否向角膜上皮样细胞分化作初步探索，探讨MSC应用于眼表组织工程的可能性。 目的：建立恒河猴骨髓间充质干细胞的体外分离、克隆筛选培养及扩增的方法。并探索了在体外基质微环境中经LPS干预联合细胞因子诱导MSC向角膜上皮样细胞方向分化的可能性，为临床上利用间充质干细胞修复眼表提供前期实验资料。 方法：采用密度梯度离心结合贴壁法筛选MSC，利用克隆培养法获得高质量的MSC。取生长良好的细胞进行形态学观察、染色体检测、生长曲线测定、细胞周期检测，并应用流式细胞分析结合免疫组化方法及多向分化潜能实验鉴定克隆化MSC。取P3代克隆化MSC，接种在预置有去上皮羊膜基质的Transwell 6孔培养板底，在Transwell体系中与恒河猴角膜缘上皮细胞非接触性共培养，分三组进行诱导实验：A基础培养液由90％MSCGM和10％胎牛血清构成；B组培养液在A组培养液的基础上添加10 μg/ml insulin、8 μg/mlRetinoic acid、10 μgl/ml EGF、10ng/ml bFGF；C组培养液在B组培养液的基础上添加1 μg/ml LPs，诱导10天后分别用电镜观察诱导后细胞形态、免疫组织化学和流式细胞分析检测诱导细胞的标志物表达情况。结果：经克隆筛选培养的传代MSC，细胞呈均匀分布的集落样生长，形态趋向于长梭形，细胞的均质性高，传至第15代时细胞仍未出现明显老化，染色体检查核型正常；细胞周期连续检测10代，其G0/G1期的细胞均占80％左右，说明绝大多数细胞处于静止期。细胞生长曲线测定显示P1、P3、P5、P10代细胞生长无明显下降趋势；免疫组化显示MSC的波形蛋白(Vimentin)、肌动蛋白(a-SMA)、CD44为阳性；流式细胞分析结果显示表达相关的抗原标记CD29，不表达造血细胞系的表面标志CD34、CD45、CD80、CD86、CD106及主要组织相容性抗原HLA-DR；多向分化潜能实验显示培养的细胞具备向成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经样细胞分化的能力；提示培养的细胞是骨髓来源的有多向分化能力的间充质干细胞。P3代克隆化MSC在体外基质微环境中诱导10天后，C组MSC光镜、电镜显示出上皮样细胞结构，免疫组化显示三组实验标志物表达情况：A组Integrinβ 1强阳性、Cx43、Pax6、P63阴性；B组Integrinβ 1阳性、Cx43阴性、Pax6弱阳性、P63阴性；C组Integrinβ 1阳性、Cx43、Pax6阳性、P63弱阳性；流式细胞检测三组标志物表达水平分别为：B组Cx43、Pax6、P63的表达较A组分别增加2倍(P<0.01)、4.5倍(P<0.001)、2倍(P>0.05)；C组Cx43、Pax6、P63的表达较A组分别增加6.5倍(P<0.001)、9倍(P<0.001)、8倍(P<0.05)；而B组、C组Integrinβ1的表达较A组降低4倍(P<0.001)和2.5倍(P<0.001)。 结论：利用Percoll密度梯度离心结合贴壁法分离MSC，联合克隆筛选法培养，可以得到一定数量、高纯度、高质量的MSC，细胞在体外连续培养至15代仍保持旺盛的增殖能力和稳定的遗传性能。MSC体外基质微环境中经LPS干预联合细胞因子有诱导MSC向角膜干细胞诱导分化的趋势，为探索将MSC用于眼组织工程中种子细胞的来源提供了思路。