论文部分内容阅读
由恶疫霉(Phytophthora cactorum)侵染引起的植物疫病是世界性分布的土传毁灭性病害,危害超过200种植物,常给草莓、苹果、梨、番茄和花卉等多种经济作物的生产带来严重损失。近年来,我国以水果、蔬菜、花卉等为主的设施农业得到快速发展,由恶疫霉引起的植物疫病对设施农业的威胁也日趋严重。从疫霉菌与植物互作的角度出发深入了解疫霉菌致病的分子机理,可为新的杀菌剂作用靶标开发和植物疫病控制策略设计提供重要指导。基于前期恶疫霉转录组测序结果,本研究利用半定量RT-PCR技术首先分析了选取的32个致病相关基因在4个不同生长发育时期(菌丝、游动孢子囊、游动孢子和萌发休止孢)和侵染本氏烟阶段(接种后1.5、3、6、12、24、48、96 h)的转录特征。结果显示,13个基因在恶疫霉生长发育阶段和侵染阶段差异上调表达,其中包括8个PcF/SCR效应分子编码基因。通过高保真扩增技术将这13个效应分子编码基因克隆到马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)表达载体pGR107中,利用农杆菌介导的基因瞬时表达法分析这些效应分子是否能够引起植物细胞死亡(Plant cell death, PCD)。结果表明,4个：PcF/SCR效应分子U866、U14169、U16448和U18031能够在番茄上引起PCD,并且U866和U16448也能够触发本氏烟的PCD。另外激发素(elicitin)效应分子U7626和NLP效应分子U2101能够触发本氏烟的PCD,其中U7626也能够在三生烟上引起PCD。为进一步明确PcF/SCR效应分子在恶疫霉致病过程中的作用,本研究首先建立了CaCl2-Polyethylene glycol (PEG)介导的恶疫霉原生质体转化方法以进行基因沉默分析。首先确定了恶疫霉对遗传霉素G418的抗性筛选浓度,然后通过转入外源的绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)基因对转化方法进行验证,通过在荧光显微镜下对转化子及转化子单孢纯化株的菌丝进行观察,发现均发出绿色荧光,表明恶疫霉稳定转化体系的成功建立。然后,利用建立的稳定转化方法对PcF/SCR效应分子U866在恶疫霉中进行了基因稳定沉默。结果显示,与对照菌株相比,基因沉默转化子对本氏烟的致病力显著下降,对外源活性氧的敏感性显著增强,表明该效应分子在恶疫霉与寄主植物的互作过程中发挥着重要作用。本研究筛选获得了8个恶疫霉PcF/SCR效应分子,明确了这些基因在恶疫霉生长发育和侵染阶段差异上调表达的特征；克隆了基因全长序列；利用基因瞬时表达分析获得了2个引起本氏烟PCD和4个引起番茄PCD的PcF/SCR效应分子；利用原生质体转化技术干扰PcF/SCR效应分子编码基因的表达,明确了U866效应分子对恶疫霉的致病性具有重要作用。研究结果首次明晰了PcF/SCR效应分子在恶疫霉致病过程中的重要影响,为深入理解恶疫霉致病分子机理提供了重要的实验证据,为设计植物疫病控制策略提供了理论指导。