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疯草是豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称,其主要毒性成分是苦马豆素(swainsonine,SW),疯草中的苦马豆素主要由链格孢属波状芽管孢组疯草内生真菌(Alternaria Section Undiflum spp)产生。近年研究表明,在产苦马豆素真菌中存在一类结构相似的基因簇,称为苦马豆素合成基因簇(swainsonine biosynthesis gene cluster,SWN)。疯草内生真菌的 SWN基因簇主要由 swnA、swnR、swnN、swnH1、swnH2和swnK等基因组成,这些基因可能在真菌从L-哌可酸到苦马豆素这一合成途径中发挥着重要作用,但在疯草内生真菌中的具体功能仍未得到验证。swnK基因是SWN基因簇中的多功能酶编码基因,由A、KS、AT、SDR、SDRel等多个区域组成,可能在真菌苦马豆素合成中发挥最主要的作用,swnK基因功能的研究,将为进一步阐明疯草内生真菌合成苦马豆素的机理奠定基础。swnK基因是产苦马豆素真菌的特有基因,若针对该基因构建特异性的疯草内生真菌定量检测方法,将为进一步阐释疯草内生真菌在疯草中的分布及其与疯草中苦马豆素含量的关系奠定基础。主要研究结果如下:1.本研究首先根据疯草内生真菌swnK基因KS序列构建一种可用于疯草植物组织中产苦马豆素内生真菌定量分析的荧光定量PCR检测技术,并应用该方法对黄花棘豆植物样品中的产苦马豆素内生真菌进行定量检测,初步分析黄花棘豆植物样品中内生真菌生物量与苦马豆素含量的关系。结果表明,基于swnK基因中的KS序列构建的实时荧光定量PCR法特异性较好,灵敏性较高,当真菌起始DNA浓度在0.009～90 ng/μL范围时,内生真菌起始DNA浓度的对数值与Ct值呈现负相关,内生真菌DNA的最低检出限为0.009 ng/μL。应用该方法对黄花棘豆内生真菌生物量的分析结果表明,内生真菌生物量与其苦马豆素含量呈正相关。本研究中基于swnK基因中KS序列构建的用于疯草内生真菌生物量检测的实时荧光定量PCR方法特异性要高于基于ITS序列构建的方法,可用于疯草中产苦马豆素内生真菌的定量分析,为疯草内生真菌及其与疯草中苦马豆素含量关系的研究提供了重要的技术支撑。2.其次,本研究对疯草内生真菌野生型菌株UA003、经甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate,EMS)诱变处理的UA003突变菌株E02,E23和E25及苦马豆素产率极低的来源于直立黄芪的甘肃链格孢菌株EA的SWN基因簇各基因的表达模式及其与苦马豆素产率的关系进行分析,并对各菌株swnK基因的突变位点及其编码产物进行比对。结果表明,SWN基因簇各基因在5株试验菌株中均有表达,但在不同菌株中各基因的表达模式存在差异。与野生型菌株UA003相比,经EMS诱变处理后筛选出的苦马豆素产率显著增加的E02、E23和E25菌株,其swnK基因中的A、KS、SDR和SDRe1基因表达均上调,与各菌株的苦马豆素产率呈正相关关系。AATL、swnR、swnN、swnH1及swnH2在E02、E23、E25菌株中均表达下调,与真菌苦马豆素产率呈负相关关系。swnK基因序列比对结果表明,5株真菌的swnK基因序列都与已公开的疯草内生真菌Alternaria oxytropis(KY365741.1)的swnK基因序列具有较高同源性(序列一致性为97.55%～99.97%)。E02、E23和E25菌株与野生型菌株UA003相比,其swnK基因发生了核苷酸位点突变,但其编码的氨基酸序列未发生变化,属于同义突变。EA菌株与疯草内生真菌Alternaria oxytropis(KY365741.1)相比,出现多处核苷酸位点突变,其中在swnK基因的A区域存在缺失片段,在AT区域出现插入片段,EA菌株swnK基因编码的氨基酸与其他菌株存在差异,属于移码突变。3.最后,本研究采用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的swnK基因敲除盒,并将其转入疯草内生真菌原生质体,敲除真菌swnK基因,并应用PCR法对转化子进行筛选。经过两轮PCR扩增后构建了基因敲除盒的上游片段L1H1和下游片段L2H2,序列分析结果表明,L1H1中含有KS基因上游同源臂序列和hph基因的上游片段,L2H2中含有KS基因下游同源臂序列和hph基因的下游片段,表明swnK基因敲除盒构建成功。将其转化原生质体并再生后,转化子可在含有潮霉素的再生培养基上生长。经PCR法筛选确定,2株转化子的DNA模板能够同时扩增出KS基因的上、下游同源臂片段和hph基因的片段,不能扩增出KS基因,表明2株阳性转化子中hph基因整合到了真菌基因组中,swnK基因的KS区域被成功敲除。本研究将为进一步确定swnK基因在疯草内生真菌苦马豆素合成中的功能奠定基础。