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癌症是目前威胁人类生命健康的最大杀手之一,也是当前医学工作者面临的重大挑战之一。研究显示,因癌症去世的患者人数在逐年增长,且呈现出年轻化的趋势。用纳米材料运输抗癌药物,可以显著提高药物的治疗效果。其中,高分子纳米药物载体相较于其他无机纳米药物载体显示出了更高的生物相容性及药物负载率,已有多个高分子纳米药物载体被用于癌症的临床治疗或已进入临床试验阶段。但纳米材料也会对生物体造成伤害。因此,对高分子纳米药物载体的定量检测及生物学效应研究极为重要。 新型的高分子纳米药物载体油胺枝接聚琥珀酰亚胺(PSIOAm),具有尺寸小、靶向好、在血管中无毒性以及药物缓释的优点,极有望成为一种安全高效的药物载体。本研究以该材料为研究对象,旨在利用免疫分析技术建立高分子纳米药物载体定量检测的新方法,对免疫后兔的组织器官采取免疫组织化学方法探究其生物学效应。具体工作如下: 1.PSIOAm抗原及其抗体的制备 采用自组装的方法制备了两种不同浓度的PSIOAm纳米药物载体,以其作半抗原,采用PSIOAm连接缩氨酸的方法,将其偶联上牛血清蛋白(BSA),得到PSIOAm免疫原。以该免疫原对新西兰大白兔进行皮下注射免疫,最终获得效价达1:32000的抗PSIOAm抗体。 2.直接竞争酶联免疫法定量检测PSIOAm 利用制备出的高特异性抗体,建立了直接竞争酶联免疫分析法定量检测PSIOAm的新方法。对抗原抗体结合比、封闭剂浓度、缓冲液的离子强度和pH等实验条件进行了优化。在最优条件下得到的标准曲线的线性方程为A=0.73-0.09lgC(A为吸光度值,C为PSIOAm的浓度),相关系数R2为0.985,线性范围为1.0×10-3~1.0×103 ng/mL,最低检测限(LOD)为0.05ng/mL。样品的加标回收率为88.8%~109%,相似物的交叉反应率低于0.01%。该方法操作简单、灵敏度高、特异性强,适于PSIOAm的定量检测。 3.间接竞争酶联免疫法定量检测PSIOAm 借助辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗的放大信号作用,采用间接竞争酶联免疫分析法对PSIOAm进行了定量检测。并对抗原抗体结合比、封闭剂浓度、酶标二抗稀释比、缓冲液的离子强度和pH等实验条件进行了优化。在最优条件下,标准曲线线性方程为A=1.26-0.15lgC(A为吸光度值,C为PSIOAm的浓度),相关系数R2为0.993,线性范围为1.0×10-2~1.0×104 ng/mL,最低检测限(LOD)为0.03ng/mL。样品的加标回收率为86.9%~118%,相似物的交叉反应率低于0.01%。相较于直接竞争酶联免疫法,该方法具有更高的灵敏度,为PSIOAm的定量检测提供了又一有效手段。 4.PSIOAm的生物学效应的研究 采用苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色的方法,研究了被PSIOAm免疫过的实验兔与空白对照组实验兔的肝脏情况。利用光学显微镜对组织切片进行了观察对比,发现实验组与对照组的肝脏组织在细胞形态上无明显区别,肝细胞和肝血窦均清晰可见。利用Image-Pro Plus软件对免疫组化的图片进行光密度测量,并利用SPSS软件对测量出的光密度值进行统计学分析,发现实验组与对照组在谷草转氨酶(GOT2)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达量上无统计学差异,初步判断PSIOAm对实验兔的肝脏没有造成显著伤害,适合作为一种新型纳米药物载体应用于临床医药领域。