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目的:本研究运用同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)干预H9C2大鼠心肌细胞模拟凋亡模型,观察吡非尼酮(pirfenidone,PFD)预处理对Hcy诱导H9C2细胞凋亡的保护作用,同时给与连接蛋白43(Cx43)的阻断剂Gap26和激动剂AAP10,探讨Cx43在PFD对Hcy诱导H9C2细胞凋亡过程的作用机制。方法:将H9C2心肌细胞分为Control组、Hcy处理组(3 mmol/l的Hcy孵育24 h)和PFD+Hcy处理组(1 mg/ml PFD预处理30 min后加入3 mmol/l的Hcy孵育24 h)。运用CCK-8法检测不同浓度(0.1、0.5、1、2、3 mmol/l)的Hcy和不同浓度(0.1、0.5、1、1.5 mg/ml)的PFD对H9C2心肌细胞的活力影响;运用倒置显微镜观察H9C2心肌细胞状态;运用流式细胞术检测H9C2心肌细胞的凋亡率;运用免疫荧光观察H9C2心肌细胞Cx43、Bax、Bcl-2和caspase-3的定位及表达;运用q RT-PCR和Western blot法检测H9C2心肌细胞Cx43、Bax、Bcl-2和caspase-3的m RNA和蛋白的表达。结果:(1)CCK-8法结果显示Hcy可呈浓度依赖性的降低心肌细胞活力;0.1-1mg/ml的PFD可维持H9C2心肌细胞的活力,但1.5mg/ml的PFD处理时能明显降低H9C2心肌细胞活力;与Hcy组相比,PFD+Hcy组的细胞活力以浓度依赖性方式增加。细胞形态学结果发现Hcy处理组细胞显示出明显的排列紊乱和广泛的细胞皱缩,但PFD+Hcy的细胞状态得到了显著改善。(2)Hcy处理组可显著增加心肌细胞的凋亡率,而PFD+Hcy组明显降低了细胞凋亡率。与Control组相比,Hcy组上调了Bax/Bcl-2比例并增加了活化的caspase-3的蛋白表达,PFD+Hcy组较Hcy组明显降低了Bax/Bcl-2比例和活化的caspase-3的蛋白表达。免疫荧光染色检测H9C2心肌细胞中Bax,Bcl-2和caspase-3的表达和分布。结果表明,Bax和caspase-3主要分布在细胞质中;Bcl-2主要分布在核膜中。每组中Bax,Bcl-2和caspase-3的表达变化与蛋白质印迹的结果一致。q RT-PCR显示Hcy处理后,H9C2细胞中Bax/Bcl-2的比值和caspase-3 m RNA的表达增加,而用PFD预处理后,PFD+Hcy组较Hcy组明显降低了Bax/Bcl-2和caspase-3 m RNA的表达。(3)PFD+Hcy组较Hcy组明显下调Cx43的蛋白表达。免疫荧光结果表明Cx43主要分布在细胞质和细胞膜中。每组的Cx43荧光强度和m RNA水平与蛋白质印迹的结果一致。将H9C2心肌细胞用Cx43抑制剂Gap26预处理,然后用Hcy干预24 h。Gap26预处理组较Hcy组细胞凋亡率显著降低。Bax/Bcl-2比值、活化的caspase-3及Cx43的蛋白表达Gap26预处理组较Hcy组明显降低。同时,每组中Bax,Bcl-2,caspase-3和Cx43 m RNA表达的变化与蛋白质印迹一致。(4)将H9C2心肌细胞用Cx43激动剂AAP10预处理。与Hcy组相比,PFD+Hcy组细胞凋亡率明显降低,而AAP10预处理组较PFD+Hcy组能明显增加细胞凋亡率。PFD+Hcy组较Hcy组明显降低Bax/Bcl-2的比值,活化的caspase-3和Cx43的蛋白表达,而AAP10预处理组较PFD+Hcy组明显增加Bax/Bcl2的比值,活化的caspase-3和Cx43的蛋白表达。与PFD+Hcy组相比,AAP10预处理组明显上调了Bax/Bcl-2,caspase-3和Cx43的m RNA表达水平。结论:PFD通过抑制Cx43信号传导途径保护Hcy诱导的H9C2心肌细胞凋亡。