黑木耳（Auricularia heimuer）栽培历史悠久,同时食药用价值极高,是我国的第二大食用菌。在习总书记提出了“小木耳、大产业”的重大指示之后,黑木耳产业迎来了更大的政策扶持和社会认可,将继续在乡村振兴上发挥更大作用。然而,伴随我国黑木耳产业突飞猛进的发展,也出现了一些亟待解决的产业问题,其中生产上菌种退化问题突出。菌种是食用菌生产中重要的基础性资料,发挥着“种子”作用。菌种质量的优劣对食用菌产业的高产、优质和健康发展起关键作用,因此采用系统的方法进行菌种质量评价、对退化菌株进行高效筛选和有效的复壮方法是至关重要的。本研究从生物学水平、蛋白质水平、DNA水平出发对6个黑木耳品种不同转管次数的18株菌株开展菌落形态观察、拮抗反应、酯酶同工酶比较、SRAP分子标记分析进行系统评价筛选退化菌株,并对退化菌株通过组织分离、菌丝尖端分离、组分结合尖端分离三种方式进行复壮,对得到的复壮菌株采取菌丝生长速度测定、LBL脱色法进行验证。旨在通过综合评价筛选黑木耳退化菌株并探究退化菌种的有效复壮方式。主要研究成果如下:1、退化菌株的筛选:通过菌落形态观察发现不同转管次数菌株间整体上表现出菌落表型、菌丝萌发天数和菌丝生长速度存在差异,其中A2、B2、C6、D2品种处理间差异性显著,表现为菌丝浓密度增加且菌落边缘不整齐,较难长满PDA平板,菌落颜色洁白度下降且有色素分泌。部分菌株菌丝萌发天数慢至4～5d,菌丝生长速度除菌株B2外在0.57～1.70mm/d之间,从菌落表型性状筛选出4株退化菌株为A2:4d,1.70mm/d;B2:2d,3.90mm/d;C6:2d,1.45mm/d;D2:5d,0.57mm/d。通过同品种不同转管次数菌株之间进行两两拮抗试验,其中B、C、D品种不同转管次数菌株之间出现拮抗线,A、E、F 3个品种不同转管次数菌株之间未出现拮抗线,由拮抗试验结果筛选出3株退化菌株为B2,C6,D2,与另外两个转管次数菌株产生明显拮抗现象。通过酯酶同工酶谱带比较,A、B、D、F 4个品种不同转管次数菌株之间出现酶谱带的差异性,聚类分析表明,A、B、D、F 4个品种不同转管次数菌株之间的遗传相似系数在0.24～0.88,A2、B2分别在遗传相似系数为0.56、0.24自成一类,表现出与另外两个转管次数菌株显著的遗传距离差异性。从153对SRAP通用引物中筛选出多态性强的8对引物进行SRAP-PCR扩增,聚类分析表明,C、D、E 3个品种不同转管次数菌株遗传相似系数在0.79～0.93之间,C6在遗传相似系数为0.79时,与另外两个转管次数菌株聚为两类,自成一类。综上,同一品种不同转管次数菌株在不同水平上的差异体现了不同程度的退化,共筛选出6株不同退化程度菌株,其中D2仅在生物学水平表现出差异,说明退化程度较轻,A2、B2在蛋白质水平发生改变,C6在DNA水平发生改变,表明退化严重。2、退化菌株的复壮:基于团队前期对6个品种出耳试验的结果,A、B、F 3个品种有子实体材料,采用组织分离、尖端分离、组分结合尖端分离三种复壮方式,获得15株组织分离菌株,通过菌丝萌发天数和菌丝生长速度比较,筛选出3株组分复壮菌株A2z、B2z、F6z;尖端分离连续分离3次,测定生长速度发现在2次后菌丝生长速度趋于稳定,最终获得3株尖端分离复壮菌株A2t,B2t,F6t,3株组分结合尖端分离复壮菌株A2k,B2k,F6k。C、D、E 3个品种无子实体材料,仅采用尖端分离复壮方式,获得3株复壮菌株C6t,D2t,E0t。优化了尖端分离复壮方法,借助可视显微镜进行单根菌丝尖端分离。在20～100倍数放大下能够成功取到单根菌丝尖端1～2mm部分并且菌丝能够成活,具有可行性。3、复壮菌株的验证:通过各品种复壮菌株与退化菌株、正常菌株的菌丝生长速度测定结果表明:A、B、F3个品种复壮菌株的菌丝生长速度均高于退化菌株,其中组织分离复壮菌株A2z、B2z、F6z与退化菌株差异显著,且F6z显著高于正常菌株,A2z、B2z与正常菌株差异不显著。C、D、E 3个品种的尖端分离复壮菌株显著高于退化菌株,其中C6t与正常菌株差异不显著、D2t与正常菌株存在显著差异、E0t显著高于正常菌株。综上在具有子实体材料情况下建议优先采用组织分离方法进行复壮,较难获得子实体材料的情况下可采用菌丝尖端分离达到对菌丝生长的复壮效果。通过对退化菌株、复壮菌株、正常菌株进行LBL脱色反应试验,观察培养基颜色、测定培养基pH值并测定培养基吸光度计算菌株脱色率,菌丝活力强的菌株所在培养基接近橙黄色、pH值较小,反之接近蓝绿色、pH值较大,综合分析并以脱色率对菌株脱色能力进行量化,结果表明:A、B、F 3个品种通过组织分离方式复壮效果较好,脱色率分别为A2z:89%;B2z:84%;F6z:78%,显著高于退化菌株,且与正常菌株差异不显著。C、D、E 3个品种通过菌丝尖端分离复壮效果较好,脱色率为C6t:51%;D2t:92%;E0t:87%,D、E品种复壮菌株显著高于退化菌株且与正常菌株差异不显著。综合得出,对于难得到子实体材料情况下采用菌丝尖端分离复壮是可行的,这与菌丝生长速度的验证结果一致。LBL脱色法在评价复壮效果的同时也验证了对于退化菌株筛选的结果,即随着菌丝生长活力的下降,LBL培养基的pH会升高、颜色加深,菌株脱色率下降。此方法操作简便,相对节省时间,证明了LBL脱色法在黑木耳菌种质量评价上具有可行性。