背景：　　人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A（Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3A, APOBEC3A，或A3A），是细胞固有免疫的抗病毒功能因子之一，可使单链DNA或RNA的胞嘧啶残基脱氨基转化为尿嘧啶，重新编码病毒基因，能够抑制多种病毒的复制，如抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）、人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)等病毒的复制。研究发现α干扰素（interferon α，IFN-α）可以上调肝细胞A3A表达，引发HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA， cccDNA ）的胞嘧啶残基脱氨基转变为尿嘧啶残基，进而启动剪辑切除修复（base-excision repair, BER）机制，导致cccDNA降解。该发现为治愈HBV带来希望。然而A3A脱氨基功能存在特异性问题，不仅对病毒等外源性DNA发挥脱氨基作用，也可对细胞基因组产生编辑作用，引起宿主细胞DNA损伤和基因组突变，影响其抗病毒效应和安全性。而乙肝病毒核心蛋白（hepatitis B virus core，HBc）具有特异结合HBV cccDNA和HBV mRNA的特性。为进一步提高A3A抑制HBV复制的效应，本课题拟构建A3A-HBc融合蛋白，以期增强A3A靶向结合HBV cccDNA和RNA的能力，从而增强其抗病毒效应。　　目的：　　为提高A3A抑制HBV复制的效应，构建载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A (APOBEC3A，或A3A)与全长或截短体乙型肝炎病毒核心蛋白（HBc）的融合蛋白表达载体，研究融合蛋白在细胞内的表达和定位，并鉴定其胞嘧啶脱氨酶活性；最后初步研究其抗病毒作用。　　方法：　　（1）采用In-Fusion重组克隆方法，将含有A3A的PCR产物分别和含有全长HBc或四种C端截短体（HBc144S、HBc144E、HBc144AAA、HBc144A）的PCR扩增片段连接克隆入真核表达载体pcDNA3.0，分别构建真核表达载体pcA3A-HBc、pc A3A-HBc144S、pcA3A-HBc144E、pcA3A-HBc144AAA、pcA3A-HBc144A。将五种重组质粒分别转染常用的外源基因高表达细胞株HEK293T，通过Western blot鉴定五种融合蛋白的表达，免疫荧光细胞化学染色分析五种融合蛋白在 HEK293T 细胞中的定位分布，体外尿素变性PAGE法分析融合蛋白对单链DNA的胞苷脱氨酶活性。　　（ 2 ）通过共转染的方法在肝癌细胞 Huh7 中分别共转染 HBV 复制表达质粒pCH-3091与pcA3A质粒或五种融合蛋白的重组质粒，免疫荧光细胞化学染色法分析五种融合蛋白在细胞中的表达定位；CCK8 法和流式细胞技术检测五种融合蛋白对 Huh7 细胞毒性和细胞周期的影响；采用 ELISA 法检测培养细胞上清中 HBsAg和HBeAg的水平；实时定量PCR法检测细胞裂解液中HBV DNA的水平。　　结果：　　（1）DNA测序证实五种重组质粒构建成功；五种重组质粒都能在HEK293T细胞中表达融合蛋白，4种含截短体HBc的融合蛋白表达能力比含全长HBc融合蛋白的表达能力强；含全长HBc的融合蛋白A3A-HBc主要定位于细胞质，而含截短体HBc的融合蛋白（A3A-HBc144S、A3A-HBc144E、A3A-HBc144AAA、A3A-HBc144A）均主要定位于细胞核；含截短体HBc的融合蛋白与A3A对照的胞嘧啶脱氨基活性无显著差异，且均高于含全长HBc融合蛋的胞嘧啶脱氨基活性。　　（2）在抗病毒实验的Huh7细胞模型中，含全长HBc的融合蛋白主要定位于细胞质；四种含截短体HBc的融合蛋白主要位于细胞核。五种融合蛋白对Huh7细胞毒性和周期影响不显著。　　（3）在抗病毒实验模型Huh7细胞中，3天时，与空载体pcDNA3.0对照组相比， A3A-HBc144S、A3A-HBc144E、A3A-HBc144AAA、A3A-HBc144A 各组细胞上清中的HBsAg水平分别为（31.44±1.90%、11.42±2.74%、18.36±6.06%、43.76±0.66%， p<0.05）；各组细胞上清中HBeAg的水平分别为59.51±2.61%（p<0.05）、32.95±2.47%（p<0.05）、45.86±2.61%，（p<0.05）和84.18±11.03%（p>0.05）；各组细胞裂解液中HBV DNA的水平分别为75.65±2.68%、46.80±3.39%、58.04±9.21%、54.10±6.65%， p<0.05），其中融合蛋白A3A-HBc144E和A3A-HBc144AAA组HBsAg、HBeAg、HBV DNA 降低最显著。7 天时，上述各组细胞上清中的 HBsAg 水平分别为（56.85±9.79%、12.15±2.12%、21.32±7.24%、56.50±2.93%，p<0.05）；各组细胞上清中HBeAg的水平分别为（64.91±12.14%、38.13±4.75%、42.28±0.06%，58.71±0.92%， p<0.05）；各组细胞裂解液中 HBV DNA 的水平分别为 80.61±3.65%（p<0.05）、87.07±9.13%（p>0.05）、54.52±6.21%（p<0.05）、52.60±3.21%（p<0.05）。7天时， A3A-HBc144E 和 A3A-HBc144AAA 组 HBsAg、HBeAg 水平降低最显著，但是A3A-144E 组HBV DNA水平降低不显著。　　结论：　　（1）成功构建A3A与全长或截短体HBc的融合蛋白真核表达载体并在HEK293T细胞和Huh7细胞中表达。　　（2）含截短体HBc的融合蛋白与A3A的胞嘧啶脱氨基活性相当，而含全长HBc融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性低于A3A的胞嘧啶脱氨基活性。　　（3）含全长HBc融合蛋白主要定位于细胞质；四种截短体HBc融合蛋白主要位于细胞核。　　（4）体外实验显示含截短体HBc的融合蛋白均具有潜在抑制HBV复制和表达的作用。其中两种融合蛋白（A3A-HBc144E和A3A-HBc144AAA）潜在的抑制作用较强，该研究为后续进一步研究抗病毒作用奠定实验基础。　　（3）在抗病毒实验模型Huh7细胞中，3天时，与空载体pcDNA3.0对照组相比， A3A-HBc144S、A3A-HBc144E、A3A-HBc144AAA、A3A-HBc144A 各组细胞上清中的HBsAg水平分别为（31.44±1.90%、11.42±2.74%、18.36±6.06%、43.76±0.66%， p<0.05）；各组细胞上清中HBeAg的水平分别为59.51±2.61%（p<0.05）、32.95±2.47%（p<0.05）、45.86±2.61%，（p<0.05）和84.18±11.03%（p>0.05）；各组细胞裂解液中HBV DNA的水平分别为75.65±2.68%、46.80±3.39%、58.04±9.21%、54.10±6.65%， p<0.05），其中融合蛋白A3A-HBc144E和A3A-HBc144AAA组HBsAg、HBeAg、HBV DNA 降低最显著。7 天时，上述各组细胞上清中的 HBsAg 水平分别为（56.85±9.79%、12.15±2.12%、21.32±7.24%、56.50±2.93%，p<0.05）；各组细胞上清中HBeAg的水平分别为（64.91±12.14%、38.13±4.75%、42.28±0.06%，58.71±0.92%， p<0.05）；各组细胞裂解液中 HBV DNA 的水平分别为 80.61±3.65%（p<0.05）、87.07±9.13%（p>0.05）、54.52±6.21%（p<0.05）、52.60±3.21%（p<0.05）。7天时， A3A-HBc144E 和 A3A-HBc144AAA 组 HBsAg、HBeAg 水平降低最显著，但是A3A-144E 组HBV DNA水平降低不显著。　　结论：　　（1）成功构建A3A与全长或截短体HBc的融合蛋白真核表达载体并在HEK293T细胞和Huh7细胞中表达。　　（2）含截短体HBc的融合蛋白与A3A的胞嘧啶脱氨基活性相当，而含全长HBc融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性低于A3A的胞嘧啶脱氨基活性。　　（3）含全长HBc融合蛋白主要定位于细胞质；四种截短体HBc融合蛋白主要位于细胞核。　　（4）体外实验显示含截短体HBc的融合蛋白均具有潜在抑制HBV复制和表达的作用。其中两种融合蛋白（A3A-HBc144E和A3A-HBc144AAA）潜在的抑制作用较强，该研究为后续进一步研究抗病毒作用奠定实验基础。