体外包装和体内重组构建大型噬菌体抗体库及其用于制备噬菌体抗体芯片

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噬菌体抗体的亲和力与抗体库的容量相关,而库容量又受到建库方法的限制。作者提出了通过体外包装来构建大型噬菌体抗体库的新设想,其主要优点在于包装体系可以随意放大,由此提高库容量在理论上没有上限。由于抗体展示在丝状噬菌体表面能够获得较好的效果,而丝状噬菌体是在宿主细胞膜上组装的,其自身无法实现体外包装,因而借用λ噬菌体的体外包装系统。为此,需要在展示载体中引入λ噬菌体包装蛋白识别的包装信号。λ噬菌体的基因组远大于噬菌体展示载体,在体外包装前需要将携带抗体基因的噬菌粒DNA串联,以获得一定大小的多联体(九聚体以上)才可用于体外包装。同时,在抗体基因展示系统中引入Cre重组酶/lox位点的体内重组机制,进一步扩大了库容量,增加了抗体基因的异质性。 通过体外包装和体内重组构建大型人源噬菌体抗体库共分五个步骤。首先,对展示载体pCANTAB进行改造,插入SexAⅠ限制位点、cosλ包装信号、loxPwt和loxP511重组位点,从而使得构建的新载体pCZ4具有定向串联、体外包装、和体内重组的能力。第二,选择一个人源单链抗体(scFv)基因的单克隆,在抗体基因中引入限制位点,以便通过盒式替换将重链互补决定簇3(H-CDR3)和轻链互补决定簇3(L-CDR3)序列随机化。第三,对H-CDR3和L-CDR3进行双重随机化,即用由7个NNS三核苷酸构成的随机片段替代H-CDR3和L-CDR3而引入序列多样性。第四,通过SexAⅠ限制位点将H-CDR3和L-CDR3双重随机化后的噬菌粒DNA切开线性化并进行同向串联,然后使用λ噬菌体包装提取物对噬菌粒DNA多联体进行体外包装,用包装好的λ噬菌体颗粒感染组成型表达Cre重组酶的菌株BS1365,以进行体内重组而产生组合多样性。第五,使用辅助噬菌体M13K07回收噬菌体抗体库。使用10μg噬菌粒DNA多联体和10管包装提取物进行体外包装,最终构建了计算库容量为1.40×1010的大型人源噬菌体抗体库并进行了鉴定。 作者摸索并建立了噬菌体抗体芯片的制作和检测方法。选用环氧基片基制作蛋白质芯片能够得到较低的背景信号,因而灵敏度较高。在探针溶液中添加SDS能够获得较好的点样效果。 作者还试制了用于检测白血病的噬菌体抗体芯片。用来自正常人和白血病患者的白细胞,对所构建的噬菌体抗体库进行细胞淘选和减法淘选,获得针对白细胞表面普遍抗原和白血病特异抗原的噬菌体抗体。将抗体基因转移到基因8蛋白展示系统中,选取96个单克隆制作了用于检测白血病的噬菌体抗体芯片。用3名正常人和3名白血病患者的白细胞蛋白提取物作为检测样品,以荧光染料Cy3标记后与芯片进行反应。将两种反应图谱进行比较,初步找出能够用于甄别白血病患者的探针斑点。
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