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噬菌体抗体的亲和力与抗体库的容量相关,而库容量又受到建库方法的限制。作者提出了通过体外包装来构建大型噬菌体抗体库的新设想,其主要优点在于包装体系可以随意放大,由此提高库容量在理论上没有上限。由于抗体展示在丝状噬菌体表面能够获得较好的效果,而丝状噬菌体是在宿主细胞膜上组装的,其自身无法实现体外包装,因而借用λ噬菌体的体外包装系统。为此,需要在展示载体中引入λ噬菌体包装蛋白识别的包装信号。λ噬菌体的基因组远大于噬菌体展示载体,在体外包装前需要将携带抗体基因的噬菌粒DNA串联,以获得一定大小的多联体(九聚体以上)才可用于体外包装。同时,在抗体基因展示系统中引入Cre重组酶/lox位点的体内重组机制,进一步扩大了库容量,增加了抗体基因的异质性。
通过体外包装和体内重组构建大型人源噬菌体抗体库共分五个步骤。首先,对展示载体pCANTAB进行改造,插入SexAⅠ限制位点、cosλ包装信号、loxPwt和loxP511重组位点,从而使得构建的新载体pCZ4具有定向串联、体外包装、和体内重组的能力。第二,选择一个人源单链抗体(scFv)基因的单克隆,在抗体基因中引入限制位点,以便通过盒式替换将重链互补决定簇3(H-CDR3)和轻链互补决定簇3(L-CDR3)序列随机化。第三,对H-CDR3和L-CDR3进行双重随机化,即用由7个NNS三核苷酸构成的随机片段替代H-CDR3和L-CDR3而引入序列多样性。第四,通过SexAⅠ限制位点将H-CDR3和L-CDR3双重随机化后的噬菌粒DNA切开线性化并进行同向串联,然后使用λ噬菌体包装提取物对噬菌粒DNA多联体进行体外包装,用包装好的λ噬菌体颗粒感染组成型表达Cre重组酶的菌株BS1365,以进行体内重组而产生组合多样性。第五,使用辅助噬菌体M13K07回收噬菌体抗体库。使用10μg噬菌粒DNA多联体和10管包装提取物进行体外包装,最终构建了计算库容量为1.40×1010的大型人源噬菌体抗体库并进行了鉴定。
作者摸索并建立了噬菌体抗体芯片的制作和检测方法。选用环氧基片基制作蛋白质芯片能够得到较低的背景信号,因而灵敏度较高。在探针溶液中添加SDS能够获得较好的点样效果。
作者还试制了用于检测白血病的噬菌体抗体芯片。用来自正常人和白血病患者的白细胞,对所构建的噬菌体抗体库进行细胞淘选和减法淘选,获得针对白细胞表面普遍抗原和白血病特异抗原的噬菌体抗体。将抗体基因转移到基因8蛋白展示系统中,选取96个单克隆制作了用于检测白血病的噬菌体抗体芯片。用3名正常人和3名白血病患者的白细胞蛋白提取物作为检测样品,以荧光染料Cy3标记后与芯片进行反应。将两种反应图谱进行比较,初步找出能够用于甄别白血病患者的探针斑点。