肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),是动物肌肉生长发育过程中一个重要的负调控主效基因,MSTN基因具有组织特异性,主要在骨骼肌中特异性表达;肌抑素能调控肌肉生长、动物脂肪的沉积和骨骼的生长发育,还能影响肌键和韧带的强硬度。转录因子,即反式作用因子,是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上,参与调控靶基因转录效率的蛋白质。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中,转录调控是顺式作用元件,如启动子、增强子与反式作用因子相互作用的结果。研究蛋白质与DNA的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径;生肌决定因子家族蛋白是一种骨骼肌特异性转录因子,能通过与肌肉特异性基因调控区的结合,相互协调地启动肌肉特异性基因的表达,这是骨骼肌细胞分化成熟的关键机制。本研究选择贵州关岭黄牛作为实验对象,根据Gen Bank中牛MSTN基因序列设计PCR引物,采用PCR方法扩增关岭牛MSTN基因启动子区,并利用MSTN基因启动子序列、Promoter-Binding TF Profiling AssayⅡ试剂盒和关岭牛肌肉组织的细胞核提取物,筛选关岭牛MSTN基因启动子区的转录因子结合位点。根据筛选结果,克隆关岭牛Myo D基因的CDS区,并构建重组真核表达载体pc DNA3.1(+)-Myo D和重组载体PGL3-MSTN-Pro。将重组质粒共转染小鼠C2C12细胞系,检测其24h后的双荧光素酶活性,在细胞内验证转录因子Myo D与MSTN启动子的相互作用。构建重组原核表达载体PET32a(+)-Myo D,将重组质粒转化原核表达菌株BL21(DE3),诱导菌株表达Myo D重组蛋白,纯化目的蛋白并Western Blot验证。研究结果如下:(1)实验筛选出关岭牛MSTN基因启动子区含有Myo D、MEF2、FOXO1、SMAD、TFIID转录因子结合位点。(2)成功克隆关岭牛Myo D基因的CDS区,构建重组载体pc DNA3.1(+)-Myo D、PGL3-MSTN-Pro。(3)双荧光素酶检测结果显示,在小鼠C2C12细胞中,实验组M1/M2比值为对照组的3.6倍,且两组数据差异极显著(P<0.01)。Myo D蛋白对MSTN基因启动子活性有增强作用。(4)成功构建重组原核表达载体PET32a(+)-Myo D,并转化至原核表达菌株BL21(DE3)。(5)成功诱导原核表达菌株BL21(DE3)表达重组目的蛋白,纯化目的蛋白,Western-blot验证目的蛋白为关岭牛Myo D重组蛋白。