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抗生素已经成为临床治疗病原感染的有力武器,同时还作为畜禽饲料添加剂在畜禽疾病预防和促生长方面发挥重要作用。但随着抗生素在畜禽养殖业的长期使用,几乎所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系,致病菌的耐药性问题已经日益严重地威胁着动物和人类的健康,同时生物安全和食品安全已经引起人类的重视,在这种状况下,寻找全新类型的抗菌剂是解决抗药性问题的一条有效途径,以期获得抗菌活性更强、范围更广的新型抗菌剂。
抗菌肽(Antimicrobial Peptides,简称Aps)是一种由微生物、植物、无脊椎动物和各种动物的细胞和组织产生的一种具有抗菌活性的小肽,也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分。现在发现抗菌肽广泛分布于细菌、昆虫、植物、两栖动物和哺乳动物中,不仅对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有高效广谱的杀灭能力,而且对某些病毒、真菌和原虫也具有抑杀作用,同时对一些肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,但对真核细胞几乎没有毒不良反应。抗菌肽具有热稳定、强碱性、易溶于水、带正电荷和相对分子质量低等特点。并且抗菌肽的抗菌浓度小,抗菌浓度单位一般在μ mol/L水平,可作为传统抗生素的替代品,是一种具有巨大发展前景的新型抗菌剂。抗菌肽PR39是来源于猪骨髓中性粒细胞具有广谱抗菌活性的多肽。
本研究根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法合成改造后的PR39基因片段。基因克隆到pPICZaC质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pPICZaC-PR39。pPICZaC-PR39通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33内。ZeocinTM抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测PR39基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在AOX(醇氧化酶)启动子调控下,分子量约为4.7kD的PR39蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为284mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下10 min内抗菌活性不变,煮沸60 min仍具有活性。表达的抗菌肽PR39对大肠杆菌(Eseherichia coli)K99和金黄色葡萄球菌(CowanⅠ)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)分别为6.25μg/mL和12.5μg/mL。
以昆明种小鼠为对象,初步研究了重组抗菌肽PR39防治小鼠细菌感染的效果。通过预试验,确定了选用的金黄色葡萄球菌(cowanⅠ)和致病性大肠杆菌K99对小鼠的最小致死剂量(MLD100)。在小鼠保护实验中,通过肌注和口服不同剂量的PR39后腹腔注射致死剂量的金黄色葡萄球菌(CowanⅠ)和大肠杆菌K99,48h后小鼠存活率在12.5％和75%之间。表明,3001,tg的抗菌肽PR39具有较好的体内保护效果,口服可以吸收,但保护力不如肌注好。
选用PR39-X33为菌株,通过摇瓶发酵探索不同碳源、氮源、不同碳源初浓度、流加碳源等因素对酵母生长的影响。结果表明选用葡萄糖作为碳源、尿素作为氮源时性价比较高;碳源初浓度为1%,并不断流加碳源时酵母生长最好。
综上所述,本研究成功地应用基因工程和蛋白质工程技术表达了猪小肠抗菌肽PR39,该蛋白在体内外均有抗菌活性,通过对发酵条件的初步优化,为抗菌肽PR39的工业化生产和在畜牧养殖业中的应用奠定基础。