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【背景】目前,全球约有5亿人患有糖尿病,其中绝大多数为2型糖尿病（T2DM）。糖尿病患者患骨质疏松、骨折以及骨愈合不良的风险很高。即使是血糖控制稳定的患者,其牙槽骨缺损的愈合情况也比非糖尿病患者差。这可能与其骨代谢异常、骨髓微血管病变以及血管功能障碍有关。骨组织工程技术在治疗糖尿病患者的骨缺损方面具有很大的优势和前景。间充质干细胞（MSCs）作为种子细胞为组织工程骨提供了良好的成骨性以及骨诱导性;同时其来源广泛,易于体外扩增,弥补了自体骨移植数量有限的缺点。当组织损伤或者缺氧时,内皮细胞（ECs）可以激活细胞骨架重组和细胞芽生的信号级联反应,迅速形成新血管。为了同时促进骨缺损区域的骨再生及血管生成,将ECs与MSCs共培养是目前比较热门的解决方案。之前的许多研究是将二者共培养细胞与刚性支架或凝胶材料联合使用。细胞膜片技术的出现可以使细胞高度聚集、不易流失,还可保存丰富的细胞外基质。它使共培养细胞不依赖支架材料就可独立运用,在骨组织工程中有很好的应用前景。目前已有多种方法来培养MSCs与ECs复合膜片,用于促进骨愈合以及血管生成,但并未有对各种方法进行系统比较的研究。且绝大多数复合膜片使用的均为骨髓来源的干细胞（BMSCs）,鲜见脂肪来源的干细胞（ASCs）与ECs复合膜片在骨修复方面的研究。此外ASCs与ECs复合膜片对糖尿病患者成骨以及成血管的作用也尚不清楚。相较于骨髓来源的BMSCs以及其他来源的成体间充质干细胞,脂肪来源的ASCs可以从全身的脂肪组织中分离提取,它的来源更加丰富,更容易获取,供区的手术创伤和并发症风险更小,临床上的适用范围更为广泛。因此,本课题研究了ASCs与ECs的相互作用,利用不同方法构建ASCs与ECs复合膜片,并研究它们在体外的成骨和成血管能力,以及在体内修复T2DM大鼠骨缺损的能力。为糖尿病骨缺损的再生治疗提供一定的理论依据。【目的】研究ASCs及ASC膜片（ASC sheet）对ECs生物学特性及成血管能力的影响;研究ECs对ASCs生物学特性及成骨能力的影响;对比研究不同方法构建ASCs与ECs复合膜片的体外成骨能力;研究ASCs与ECs复合膜片对T2DM大鼠骨愈合及血管形成的影响。本研究旨在为临床上治疗T2DM骨缺损探索一种兼具良好的成骨及成血管性能的骨移植材料。【方法】第一部分:ASCs与ECs体外相互作用的研究1.分离培养大鼠原代ASCs和ECs并进行鉴定。2.制备ASCs及ASC膜片条件培养基（ASC-CM和ASC sheet-CM）,通过CCK-8和Edu（TMB法）试剂盒检测两种培养基对ECs增殖的影响;通过划痕和穿膜实验研究两种培养基对ECs迁移能力的影响;使用两种培养基处理ECs第1、4、7天,实时定量PCR和western blot检测VEGF基因和蛋白表达;通过体外基质胶成管实验以及体内基质胶塞实验研究ASC-CM和ASC sheet-CM对ECs成血管能力的影响。3.基于聚合物共沉淀原理提取ASCs及ASC膜片外泌体（ASC-exo和ASC sheet-exo）并进行鉴定;纳米粒子追踪分析检测ASC-exo和ASC sheet-exo的粒径大小与浓度;通过划痕实验和穿膜实验检测相同浓度ASC-exo和ASC sheet-exo对ECs迁移能力的影响;通过体外基质胶成管实验以及体内基质胶塞实验研究ASCexo和ASC sheet-exo对ECs成血管能力的影响。4.制备ECs条件培养基（EC-CM）,通过CCK-8和Edu（TMB法）试剂盒检测EC-CM对ASCs增殖能力的影响;使用FITC-Annexin V和PI细胞凋亡试剂盒检测EC-CM对ASCs凋亡的影响;通过划痕实验和穿膜实验检测EC-CM对ASCs迁移能力的影响;在使用EC-CM培养ASCs的第0、1、3、5、7天检测其成骨相关基因Runx2、OCN、ALP、BMP2以及成血管相关基因VEGF的表达情况。ALP染色和茜素红染色检测EC-CM对ASCs成骨能力的影响。第二部分:ASCs与ECs复合细胞膜片对2型糖尿病大鼠颅骨极限骨缺损修复的研究5.ASCs与ECs复合细胞膜片体外成骨能力的研究（1）将ASCs和ECs按1:0,10:1,1:1,1:10以及0:1比例混合培养,成膜诱导7天制备ASCs与ECs直接共培养膜片;实时定量PCR和Western Blot检测成骨和成血管相关基因和蛋白表达;天狼星红染色和ALP染色检测各组膜片成骨诱导7天后胶原及ALP活性。（2）将ECs分别以2×10~6个、2×10~5个以及2×10~4个细胞/孔的数量接种到成膜7天的ASC膜片上制备复合膜片;实时定量PCR和Western Blot检测ALP、BMP2、Col-1、Runx2、VEGF的基因和蛋白表达情况;使用成骨诱导分化培养基对各组共培养细胞膜片进行成骨诱导,成骨诱导7天后分别行天狼星红染色以及ALP染色。（3）分别制备ASC膜片（ASC sheet）、EC膜片（EC sheet）、ASCs与ECs按1:1比例直接共培养膜片（1A1E sheet）、ECs接种到ASC膜片（ASC sheet+ECs）、ASC膜片+EC膜片（ASC sheet+EC sheet）等共5种不同种类的膜片;实时定量PCR检测成骨和成血管相关基因表达情况。6.ASCs与ECs复合膜片对T2DM大鼠骨修复作用的研究建立T2DM大鼠模型,将它们随机分配到空白对照组、单纯ASC膜片组、单纯EC膜片组、叠加膜片组（ASC膜片与EC膜片混合叠加）、1A1E膜片组（ASCs与ECs按1:1比例直接共培养膜片）、ASC膜片+EC组（ECs接种到ASC膜片上）共6组（每组8只）;手术制备直径5mm颅骨缺损并放入相应膜片;术后8周取材,Micro-CT分析骨缺损处的骨参数;脱钙后骨组织切片行HE染色,观察骨愈合情况以及新生血管数量。【结果】第一部分:ASCs与ECs体外相互作用的研究1.成功提取大鼠ASCs以及内皮细胞ECs。2.ASC-CM和ASC sheet-CM均可以促进ECs的增殖,但两者之间无统计学差异;二者均可促进ECs的水平迁移能力以及穿膜能力,ASC sheet-CM组的促进作用强于ASC-CM组;使用不同培养基处理ECs第1、4、7天,VEGF基因和蛋白的表达在ASC sheet-CM组中显著高于ASC-CM组;体外管腔实验结果显示,ASCCM组和ASC sheet-CM组成管效果好于对照组,ASC sheet-CM组的体外成管效果最好;体内基质胶塞实验结果显示,ASC-CM组和ASC sheet-CM组内均可见大量新生血管,血管数量与对照组相比具有显著差异,但二者之间差异不明显。3.成功提取ASC-exo和ASC sheet-exo,二者均呈杯状或圆形的双层膜结构,表达外泌体特异性标志物CD63、Alix和CD81;纳米粒子追踪分析显示ASC-exo的浓度大于ASC sheet-exo,但平均粒径较小;ASC-exo和ASC sheet-exo的主峰粒径无显著性差异;ASC-exo和ASC sheet-exo均可促进ECs的水平迁移能力以及穿膜能力,ASC sheet-exo组的迁移能力强于ASC-exo组;体外成管实验表明不同浓度的ASC-exo组和ASC sheet-exo组在成管效果均好于对照组,当浓度为10、100和200μg/μl时,ASC sheet-exo组的成管效果好于ASC-exo组,随着外泌体浓度增加,二者的体外成管效果越来越好;体内基质胶塞实验表明,ASC-exo和ASC sheet-exo均可以促进动物体内微血管生成,且ASC sheet-exo的促进能力更强。4.EC-CM对ASCs的增殖能力、迁移能力无显著的影响,但可以促进ALP和VEGF基因的表达。ALP染色和茜素红染色结果显示,EC-CM促进ASCs的成骨能力。第二部分:ASCs与ECs复合细胞膜片对2型糖尿病大鼠颅骨极限骨缺损修复的研究5.ASCs与ECs复合细胞膜片体外成骨能力的研究（1）构建ASCs和ECs按1:0,10:1,1:1,1:10以及0:1比例共培养膜片,随着ECs比例的增加,膜片厚度逐渐减小;1:1比例共培养组ALP与BMP2基因表达显著高于其他4组;Col-1和Runx2基因在10:1以及1:1组表达较高;VEGF基因的表达随着ECs比例的增加逐渐降低,1:1组表达在五组中处于居中的水平;蛋白的表达趋势与基因表达结果一致。（2）将ECs接种到ASC sheet上,根据ECs接种量的不同（2×10~6个、2×10~5个、2×10~4个/孔）分为多、中、少三组;ASC膜片上ECs接种量较少组Runx2和VEGF基因和蛋白表达高于ECs含量较高的两组。（3）实时定量PCR结果显示,ASC sheet+ECs组和ASC sheet+EC sheet组ALP、Runx2、VEGF的表达显著高于其他三组;ASC sheet+ECs组的ALP表达量最高;ASC sheet+EC sheet组Col-1和VEGF表达量最高;1A1E sheet组BMP2表达量最高。6.ASCs与ECs复合膜片对T2DM大鼠骨修复作用的研究（1）50只大鼠中有48只成功建立T2DM模型,成功率96%。（2）Micro-CT分析结果显示,EC膜片组和空白对照组各项骨参数无显著差异;单纯ASC膜片组成骨效果优于空白对照组（BV/TV和Tb.sp）与EC膜片组（BV/TV）;1A1E膜片组、ASC膜片+EC组与单纯ASC膜片组成骨能力相近,三组两两之间各项骨参数均无统计学差异;叠加膜片组的成骨效果最好,优于空白对照组（BV/TV、Tb.N和Tb.sp）、EC膜片组（BV/TV和Tb.N）、ASC膜片组（BV/TV和Tb.N）以及ASC膜片+EC组（Tb.N）,但与1A1E膜片组的各项骨参数均无统计学差异。（3）骨组织切片HE染色结果显示,空白对照组与EC膜片组成骨较差,仅在骨缺损边缘有少量新骨形成;其余膜片组均可见到大量的新生骨组织。血管计数结果显示,ASC膜片组与EC膜片组血管数相近,优于空白组;叠加膜片组、1A1E膜片组和ASC膜片+EC组的血管数相近,均优于空白组、ASC膜片组与EC膜片组。【结论】1.制备了ASC sheet-CM,并证实它与ASC-CM一样,可以显著促进ECs增殖能力;在促进ECs的水平迁移能力、趋化能力,表达VEGF以及体外成管能力方面ASC sheet-CM相较于ASC-CM有显著的优势。2.提取了ASC sheet-exo,发现它与ASC-exo的粒径大小和浓度有差异,并证实它在促进ECs的水平迁移能力、趋化能力,以及体内外成管能力方面相较于ASC-exo有显著的优势。3.EC-CM对ASCs的增殖、凋亡以及迁移能力无显著的影响,但可以促进ASCs的成骨能力以及成血管相关基因VEGF基因的表达。4.ASCs和ECs比例为1:1时膜片成骨能力最强。少量ECs接种到ASC膜片上的复合膜片成骨和成血管潜力最好,优于大量接种ECs组。ASCs与ECs按1:1共培养并诱导成膜,ECs接种在ASC膜片上,ASC膜片与EC膜片叠加使用构建的三种ASCs与ECs复合膜片均具有较好的成骨与成血管潜力,优于单纯ASC膜片组以及单纯EC膜片组。5.EC膜片仅可促进T2DM大鼠的血管形成;ASCs与ECs复合膜片与ASC膜片可同时促进T2DM大鼠骨愈合以及新生血管形成;叠加膜片组T2DM大鼠骨缺损处成骨与成血管效果最好。综上所述,ASCs与ECs复合膜片,尤其是ASC膜片与EC膜片叠加使用,可以促进T2DM骨愈合与血管生成,有望成为一种有潜力的骨组织工程移植材料,用于在临床上治疗T2DM骨缺损。