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传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopietic necrosis virus,IHNV）引起的鲑鳟鱼类传染性造血器官坏死病（Infectious hematopietic necrosis,IHN）是对鲑鳟鱼养殖产业危害较为严重的一类病毒性疾病,主要危害鲑鳟鱼的鱼苗及当年鱼种,感染后的致死率可以达到100%。IHN已被世界动物卫生组织（Office International des Epizooties,OIE）规定为必须申报的动物疫病,也是我国动物疫病名录中规定的二类动物疫病。由于鱼种苗的免疫系统尚未发育完善,疫苗未能对其进行有效保护,无法解决鱼种苗的患病问题。因此,相关治疗性药物的开发显得更加迫切。目前,水产上仍未有防治IHNV的专用抗病毒药物,而本实验室前期研究发现天然产物牛蒡子苷元对IHNV具有一定的抑制效果。在此基础上,本研究以牛蒡子苷元为先导化合物,设计合成了一系列牛蒡子苷元衍生物。通过体外细胞筛选模型评价衍生物的抗病毒活性,结合比较分子力场分析（Comparative molecular field analysis,Co MFA）模型阐述衍生物的构效关系,明确抗IHNV潜在药物的化学结构并对其进行化学合成。随后,在细胞和个体水平评价抗IHNV潜在药物的抗病毒效果,深入探索其抗病毒分子机制,以期为开发水产抗IHNV专用药物及IHN防控提供理论基础。本研究取得结果如下:1. 牛蒡子苷元衍生物的合成通过Wiiliamson醚化反应、取代反应等一系列合成手段,经柱层析分离并结合波谱学方法对合成的衍生物进行结构鉴定,得到57个牛蒡子苷元衍生物,其中脱氧牛蒡子苷元衍生物1个、醚类牛蒡子苷元衍生物19个、酯类牛蒡子苷元衍生物9个、溴化牛蒡子苷元衍生物5个以及氮杂环类牛蒡子苷元衍生物23个。2. 牛蒡子苷元衍生物抗IHNV构效关系研究以57种牛蒡子苷元衍生物为研究对象,黑头软口鲦上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprini,EPC）为细胞筛选模型,通过实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术检测IHNV在宿主细胞内的增殖情况,体外筛选出26种衍生物对IHNV的抑制率超过50%。其中,衍生物56抗病毒活性最好,其半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)为1.32μM,效果显著优于阳性对照利巴韦林(IC50=1.65μM)。以衍生物56为模板分子,通过23个活性衍生物的结构与其抗IHNV活性数据,建立三维定量构效关系（Three dimension quantitative structure-activity relationship,3D-QSAR）中的Co MFA模型,并计算出模型的内部交叉验证相关系数(Internal cross validation correlation coefficient,R2cv)为0.945,最佳主成分数（Number of optimal main component,ONC）为2,非交叉验证相关系数（Non cross validation correlation coefficient,R2ncv）为0.986,标准估计误差（Standard error of estimate,SEE）为0.060,Fisher检验值（F）为577.417,立体场系数为0.715,静电场系数为0.285以及预测交叉验证相关系数(Predictive cross validation correlation coefficient,R2pred)为0.988。这些参数均证明建立的Co MFA模型有良好的预测能力,具有显著的统计学意义。对Co MFA等势图的分析表明,在牛蒡子苷元侧链羟基上的碳链末端增大空间结构、引入正电基团或者在氮杂环的2号位和4号位引入负电基团有利于抗病毒活性的提高。3. 抗IHNV潜在药物的设计、合成与活性研究依据Co MFA等势图的预测,重新设计并合成了8个新的牛蒡子苷元衍生物,发现衍生物EOA、59、60和62抗IHNV的IC50分别为0.98、1.12、1.15和1.77μM。其中衍生物EOA、59和60的抗病毒活性优于衍生物56,表明模型的预测可信,可以被用于抗IHNV药物设计。同时,通过衍生物EOA、59、60和62作用病毒滴度的检测,发现衍生物EOA能显著降低IHNV在EPC细胞中的感染力,稳定发挥抗病毒作用。细胞荧光染色发现IHNV感染细胞72 h后,EPC细胞会产生凋亡小体并伴有细胞骨架中微丝减少,而EOA处理后的细胞均正常染色,凋亡小体极少出现,微丝清晰完整。同时,通过扫描和透射电镜观察细胞超微结构,发现IHNV感染后的EPC细胞表面有大量孔洞,内部细胞核皱缩,细胞内基质流出。在经EOA处理后,EPC细胞同对照组相比无明显差异,维持良好的形态结构。流式细胞术分析结果表明,IHNV感染后有超过28.50%的EPC细胞发生凋亡,而EOA处理组的细胞相对于病毒组降低了22.74%的凋亡率,且正常细胞数和对照组基本一致,有94.24%的正常细胞。这些结果都表明衍生物EOA可以有效抑制IHNV诱导的宿主细胞凋亡。进一步在体研究发现,EOA处理后的虹鳟相对病毒组累积死亡率降低了32.00%,表明EOA可以提高IHNV感染后虹鳟的存活率。同时,q RT-PCR技术检测到EOA处理后虹鳟脾脏和肾脏组织中病毒的表达量明显降低,表明EOA可以有效控制IHNV在虹鳟脾肾组织中的增殖。此外,利用组织切片技术观察到病毒感染后的虹鳟脾肾组织红细胞丰富,有着严重的充血现象,而药物组脾肾组织则同正常虹鳟脾肾组织形态一样。通过q RT-PCR技术检测到EOA处理后脾脏和肾脏组织中促炎因子IL-8、IL-12p40和TNF-α都出现了显著的下调,与对照组相比分别下降了142.85、6.02、60.07倍和5.59、22.22、37.98倍。这些数据表明衍生物EOA可以在体发挥抗病毒作用,并且能够改善由病毒感染引起的虹鳟脾肾组织的炎症。通过以上结果,确定依据模型设计并合成的衍生物EOA有着良好的离体与在体活性,可被作为水产专用抗IHNV潜在药物。4. 衍生物EOA抗IHNV机制研究在EOA与IHNV粒子混合1、2和4 h后,通过超速离心技术分离药物与病毒,并将病毒再次感染EPC细胞。结果显示处理后的病毒在细胞中的表达量以及其引起的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）,与未处理的对照组基本一致。这说明EOA可能不是直接作用于病毒粒子起到的抗病毒效果。病毒吸附试验结果显示,EOA处理之后IHNV的表达量与对照组相似,说明其对IHNV吸附EPC细胞可能也不起作用。同时,通过时间梯度试验的结果可以看出,EOA在IHNV感染EPC细胞后的0～4h内对病毒的抑制作用明显,表明其可能是作用于病毒在宿主细胞中的复制前期。值得注意的是,自噬诱导剂雷帕霉素在72 h对IHNV的抑制率为76.23%,说明细胞自噬在某种程度上可以控制IHNV在宿主细胞中的增殖。自噬荧光检测观察到,EPC细胞在经衍生物EOA处理后出现了相当强度的自噬小体荧光。通过透射电镜观察药物处理后的细胞,结果发现了相当数量的自噬泡。进一步构建微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associatedprotein 1 light chain 3,LC3）真核表达质粒,经细胞转染、荧光显微镜和流式细胞术检测发现EOA有效地促进了p EGFP-LC3质粒在EPC细胞内的表达。这些结果表明,EOA可以特异性的激活细胞自噬。此外,免疫印迹试验（Western blotting,WB）检测的结果证实了EOA是通过激活JNK通路从而促进细胞自噬。以上结果表明,EOA是通过在IHNV复制前期引起EPC细胞自噬从而达到的抗病毒效果。综上所述,依据构效关系设计合成得到的衍生物EOA通过诱导宿主细胞自噬抑制IHNV的早期复制,从而能够在体外和体内显著地降低病毒量,有效地维持宿主细胞生长活力,减少虹鳟感染病毒后的死亡率。因此,衍生物EOA对防控IHN具有广阔的应用前景。