论文部分内容阅读
目的新生大鼠耳蜗血管纹边缘细胞（Marginal cells，MCs）的体外原代培养及大鼠内耳血管纹边缘细胞mtDNA4834缺失拟老化细胞模型的建立。方法出生0-3天的新生SD大鼠断头后，在解剖显微镜下移去双侧颞骨，并取出耳蜗侧壁血管纹组织。利用酶消化法制成细胞悬液后接种于细胞培养板，37℃，5%CO2/95%O2的培养箱中培养。MCs使用低浓度血清的动物上皮细胞培养基（Epithelial Cell Medium-animal），纯化后细胞爬片，应用普通光镜和免疫荧光的方法观察、鉴定培养的细胞。将纯化后的原代边缘细胞用不同浓度梯度的D-半乳糖处理48小时，用CCK-8筛选出适宜浓度。在时间梯度组用筛选出的浓度处理纯化后细胞，用荧光定量PCR的方法测定mtDNA4834相对缺失率，选取D-半乳糖的适宜作用时间用于后续实验。用β-半乳糖苷酶染色试剂盒鉴定该浓度和时间D-半乳糖处理后MCs的衰老表型。结果在普通光学显微镜下观察到MCs接种24小时后贴壁生长，后期形成单层“铺路石”样外观，细胞顶端可见分泌小泡，还可见由很多MCs形成的“dome”。采用低浓度血清培养基、差异性贴壁、选择性消化三种方法能去除大部分成纤维细胞等杂细胞。免疫荧光检测MCs表达角蛋白-18阳性。CCK-8检测细胞活性发现在D-半乳糖浓度为14mg/ml（p <0.05）和16mg/ml（p <0.01）时显著抑制边缘细胞活性，而浓度为12mg/ml（p>0.05）时对边缘细胞活性无明显抑制作用，因此选择12mg/ml D-半乳糖浓度处理边缘细胞。在此浓度处理下，测定不同D-半乳糖作用时间组边缘细胞mtDNA4834缺失突变率发现：120hr（p <0.05），168hr（p <0.01）and216hr（p <0.01）组的mtDNA4834缺失率与其各自时间的对照组相比差异有显著统计学意义。用β-半乳糖苷酶染色试剂盒鉴定，发现12mg/ml D-半乳糖作用120小时后的MCs呈衰老表型。结论利用酶消化法可以成功的进行耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养，纯化后可得到纯度较高的MCs。用12mg/ml D-半乳糖作用MCs120小时后可以成功建立带有mtDNA4834缺失突变的体外拟老化边缘细胞模型。目的研究转录因子PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1在离体的耳蜗血管纹边缘细胞中的表达及分布情况。探讨PGC-1a-GFP-Ad成功转染离体血管纹边缘细胞的条件。方法用免疫荧光的方法在激光共聚焦显微镜下观察PGC-1α，NRF-1，Tfam，NF-κB，FOXO-1和SIRT-1六个转录因子在离体的血管纹边缘细胞中的表达情况及分布情况。用病毒滴度复核实验和边缘细胞感染预实验复核PGC-1a-GFP–Ad的病毒滴度，筛选适宜感染边缘细胞的重组腺病毒的病毒滴度。结果在离体边缘细胞中，PGC-1α和NRF-1主要表达于细胞核；Tfam、FOXO-1和SIRT-1同时表达于细胞核和细胞质；NF-κB主要表达于细胞核，部分表达于细胞质。通过病毒滴度复核实验和边缘细胞感染预实验筛选出适宜的感染边缘细胞的重组腺病毒的病毒滴度是4×107PFU/ml。在激光共聚焦显微镜下观察到被携带目的基因PGC-1α的重组腺病毒及空载腺病毒成功感染的边缘细胞，由于表达了GFP蛋白，而呈现绿色荧光。结论发现PGC-1α、NRF-1；Tfam；NF-κB；FOXO-1；SIRT-1六个转录因子在离体的血管纹边缘细胞中都有表达及其分布情况。探讨重组腺病毒感染体外边缘细胞的最佳浓度，并转染边缘细胞成功。目的研究PGC-1α在离体边缘细胞mtDNA4834缺失突变拟老化模型中的作用及调节机制。方法将离体边缘细胞进行不同的处理后分四个实验组：C组即未经任何处理的空白对照组；G组即离体MCs经12mg/ml D-半乳糖作用120hr诱导缺失拟老化模型组；B组即离体MCs转染空载病毒后再经12mg/ml D-半乳糖作用120hr诱导缺失拟老化模型组；P组即离体MCs过表达目的基因PGC-1α后再经12mg/ml D-半乳糖作用120hr诱导缺失拟老化模型组。通过实时定量PCR检测各组mtDNA4834缺失突变率。通过western blot检测四组中PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1的蛋白表达水平的变化。通过β-半乳糖苷酶染色检测各实验组细胞的衰老情况。通过TUNEL检测各实验组细胞的凋亡情况。结果通过检测四组中mtDNA4834缺失突变率，发现已经造模组G和转染空载病毒造模组B相比空白对照组，其缺失率增高有显著意义（p <0.01），而过表达PGC-1α的P组普遍缺失率对比造摸组及转染空载病毒的B组缺失率有明显降低（p <0.01）。通过western blot检测技术分别检测四组中PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1的蛋白表达水平，发现在单纯半乳糖造模组G组和转染空载病毒组B组，上述转录因子的蛋白表达水平均升高。而在转染PGC-1α目的基因后，P组可以检测到明显的PGC-1α蛋白水平的增高，对比B组有显著统计学意义。对比B组NRF-1和Tfam蛋白表达增高有统计学意义，而NF-κB、FOXO-1和SIRT-1蛋白表达降低。检测各组β-半乳糖苷酶及TUNEL的情况，发现单纯半乳糖造模组G组和转染空载病毒组B组对比对照组C，阳性表达的细胞增多，而P组对比B组，阳性表现细胞明显减少。结论PGC-1α目的基因在边缘细胞中转染成功，并过表达PGC-1α蛋白。而过表达PGC-1α在离体边缘细胞拟老化模型中发挥保护作用，明显降低了边缘细胞因D-半乳糖诱导产生的mtDNA4834缺失突变，并且通过相关转录因子的作用，减轻边缘细胞的老化和凋亡。