论文部分内容阅读
研究目的： 1、探究Gpr97在急性肾损伤中的表达模式，明确Gpr97是否参与急性肾损伤。 2、探讨Gpr97在急性肾损伤发生与发展过程中的作用。 3、研究Gpr97加重急性肾损伤的作用机制。 研究方法： 第一部分 Gpr97在肾脏缺血再灌注损伤中的作用 1、Gpr97在急性肾脏缺血再灌注损伤模型中的表达变化 1.1、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)、蛋白质免疫印迹(western blot，WB)实验技术，检测Gpr97在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和骨髓中的表达情况。体外培养肾脏实质细胞，检测Gpr97在肾脏实质细胞中的表达情况。 1.2、选取WT雄性小鼠，建立肾脏缺血再灌注损伤动物模型，检测Gpr97的表达变化情况。 2、Gpr97在急性肾脏缺血再灌注损伤模型中的功能探究 选取雄性WT、Gpr97缺失型（Gpr97-/-）（B6.129-Adgrg3tm1Smoc）小鼠，构建肾脏IRI模型。检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组血清中肌酐和尿素氮的含量。苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)和原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling，TUNEL)技术检测肾脏组织损伤和细胞死亡情况。 第二部分 Gpr97通过调控Sema3A信号通路加重肾脏缺血再灌注损伤 1、Gpr97对Sema3A蛋白表达的影响 1.1、使用基因芯片技术检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组肾脏Semaphorin家族的表达变化情况。Real-time RT-PCR技术检测不同组小鼠组肾脏组织Sema3A的mRNA水平。WB检测不同组小鼠肾脏组织Sema3A的蛋白水平。IHC技术在肾脏组织进一步确定Sema3A的表达变化情况。 1.2、在NRK-52E细胞中，基因沉默Gpr97同时加入外源性Sema3A重组蛋白，ODG刺激细胞。检测细胞中炎症因子、细胞凋亡、Caspase-3活性以及Sema3A信号通路相关蛋白的表达变化。 2、Gpr97通过影响HuR蛋白的表达对Sema3A进行转录后调控 2.1、检测Gpr97对RNA结合蛋白HuR的调控作用。动物水平，WB检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组肾脏组织中HuR蛋白的表达变化。细胞水平，WB检测Scramble与siRNA-Gpr97Control组以及OGD组NRK-52E细胞中HuR蛋白的表达变化。IF检测基因沉默Gpr97后，OGD条件下NRK-52E细胞中HuR的表达及转位情况。 2.2、检测HuR对Sema3A的表达调控作用。Real-time RT-PCR检测基因沉默HuR后，NRK-52E细胞中Sema3A mRNA半衰期的变化情况。WB检测基因沉默Gpr97并加入HuR过表达腺病毒对OGD条件下NRK-52E细胞中Sema3A蛋白表达的影响。 3、检测HuR对Sema3A mRNA稳定性的影响 通过序列比对，分析不同种属Sema3A mRNA3UTR区ARE序列的分布情况。通过RNA-EMSA实验检测Sema3A mRNA与HuR蛋白的结合情况。双荧光素酶报告基因验证HuR对Sema3A mRNA稳定性的作用。 第三部分 Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用及机制研究 1、Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤模型中的表达变化 动物水平，选取12周龄WT、Gpr97-/-雄性小鼠，腹腔注射顺铂，诱导AKI动物模型。检测Gpr97的表达变化。细胞水平，加入顺铂刺激，WB检测Gpr97蛋白表达的变化。 2、Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤模型中的作用 检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及AKI组血清中肌酐和尿素氮含量的变化、肾脏组织损伤情况、促炎因子的表达变化情况、炎性细胞的浸润情况。 研究结果与结论： 第一部分 Gpr97在肾脏缺血再灌注损伤中的作用 1、Gpr97在肾脏缺血再灌注模型中表达显著上调 1.1、琼脂糖凝胶电泳和WB结果显示Gpr97在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓中均有表达，且在心脏、骨髓和肾脏中呈现高表达;Gpr97在肾脏实质细胞中均有表达且在肾小管上皮细胞中呈现高表达。 1.2、对WT小鼠进行造模，基因芯片技术、WB、Real-time RT-PCR和IHC结果显示，Gpr97在小鼠肾脏IRI模型中表达显著上调。进一步通过IHC检测发现在临床ATN病人肾活检组织中，Gpr97表达显著上调，且在损伤部位上调明显。IF结果显示，Gpr97主要定位在近曲小管和远曲小管。 1.3、培养NRK-52E细胞，不同方法建立体外低氧环境，检测Gpr97的表达变化情况。WB结果显示，Gpr97在三种刺激(OGD，AA/2-DG，CoCl2)诱导的体外低氧模型中表达显著上调。 2、Gpr97基因敲除明显减轻小鼠肾脏IRI 选取雄性WT、Gpr97-/-小鼠，建立小鼠肾脏IRI模型，研究Gpr97的作用。结果显示相比WT组，Gpr97基因缺失，降低血清中肌酐、尿素氮的含量。HE结果显示，Gpr97-/-小鼠肾脏组织损伤情况较轻，形态学评分与WT组有显著性差异。TUNEL结果显示，Gpr97减少肾脏组织细胞的死亡，TNUEL阳性细胞数与WT组相比明显减少，并有统计学差异。Real-time RT-PCR结果表明Gpr97-/-小鼠肾组织匀浆中促炎因子的表达量明显下调，炎性细胞的浸润明显减少。 第二部分 Gpr97通过调控Sema3A信号通路加重肾脏缺血再灌注损伤 1、Gpr97基因沉默抑制Sema3A的蛋白表达 1.1 选取雄性WT、Gpr97-/-小鼠，建立肾脏IRI模型，结果显示，Gpr97基因缺失减少Sema3A蛋白的表达。ELISA显示，IRI后Gpr97-/-小鼠血清中Sema3A的含量较WT小鼠明显降低，且与肌酐尿素氮含量呈正相关。 1.2、检测在体外模拟低氧环境时，Gpr97的表达变化情况，检测Gpr97基因沉默的保护作用与Sema3A的关系。实时RT-PCR结果表明Gpr97基因沉默可以明显降低OGD条件下NRK-52E细胞中炎症因子表达。流式细胞术结果显示，Gpr97基因沉默可以明显减少OGD后肾小管上皮细胞的死亡，减少细胞中活化的Caspase-3蛋白。WB结果显示，Gpr97基因沉默可以显著上调Stat3的磷酸化水平，增加Survivin的表达。加入Sema3A重组蛋白，逆转了这一作用。进一步证实，Gpr97基因沉默可以减轻OGD引起的炎症反应和细胞死亡，而这一作用至少是部分通过介导Sema3A信号通路产生的。 2、Gpr97通过影响HuR蛋白的表达对Sema3A进行转录后调控 2.1、Gpr97基因缺失明显降低IRI后小鼠肾脏中HuR蛋白的表达水平，降低OGD后NRK-52E细胞中HuR蛋白的表达水平，同时减少HuR的胞浆转位。基因沉默HuR降低了细胞中Sema3A的蛋白表达，缩短了Sema3A mRNA的半衰期。Gpr97缺失减少Sema3A蛋白的表达。外源性HuR过表达腺病毒的加入则逆转了这一作用。表明，Gpr97调控HuR进而调控Sema3A的表达。 2.2、基因序列比对结果显示，不同种属Sema3A mRNA3UTR区均有ARE序列，且高度保守。RNA-EMSA结果显示，HuR可以与Sema3A mRNA结合，Gpr97基因沉默减弱了这一结合。双荧光素酶实验结果表明，HuR可以与Sema3A mRNA结合，调控其稳定性。 第三部分 Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用及机制研究 1 Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤模型中表达升高 选取WT小鼠，腹腔注射顺铂，诱导AKI模型。实验结果显示，Gpr97在顺铂诱导的AKI小鼠肾脏组织中表达增加。细胞水平，加入顺铂刺激后Gpr97蛋白表达明显上调。 2、Gpr97基因敲除明显减轻顺铂诱导的急性肾损伤 选取雄性WT以及Gpr97-/-小鼠，建立顺铂诱导的AKI模型，检测Gpr97在顺铂诱导的AKI中的作用。结果显示，相比WT组Gpr97-/-小鼠在顺铂诱导的AKI模型中，肌酐、尿素氮的升高得到了抑制。HE结果显示，Gpr97-/-小鼠肾脏组织损伤情况较轻，形态学评分与WT组有显著性差异。Gpr97基因缺失导致肾脏组织匀浆中促炎因子的表达量明显下调，炎性细胞的浸润明显减少。 3、Gpr97通过调控Sema3A信号通路加重顺铂诱导的急性肾损伤 选取雄性WT以及Gpr97-/-小鼠，建立顺铂诱导的AKI模型，检测Gpr97在顺铂诱导的AKI中对Sema3A信号通路的影响。Gpr97-/-小鼠在顺铂诱导的AKI模型中，肾脏Sema3A蛋白水平较WT小鼠明显降低。AKI后Gpr97-/-小鼠血清中Sema3A的含量较WT小鼠明显降低。