烟草靶斑病是由立枯丝核菌引起的重要叶部病害。链霉菌能够产生多种类型环境友好型的次生代谢产物,这些次生代谢产物是农用抗生素潜在的来源。本文对烟草靶斑病菌进行了生防菌株的分离筛选与鉴定、发酵条件优化、活性组分的分离纯化和结构鉴定以及抗病机理等几个方面进行了系列研究,主要研究成果如下:1.采用活体平板测定法共获得对立枯丝核菌具有拮抗作用的链霉菌菌株12株,通过复筛发现菌株Stl-9、TA1123、9407、128、163和330等6株菌株对立枯丝核菌均有较稳定的抑菌活性,其中菌株TA1123的抑菌效果最好,并且该菌株对多种植物病原真菌都有不同程度的抑制作用。2.通过传统分类学及分子生物学方法对菌株TA1123进行了分类鉴定,最后将该菌株命名为淀粉酶产色链霉菌变种(Streptomyces var.diastatochrmogenes),Gene bank 登录号为KX852460。3.为了提高代谢产物产量,通过响应面法对发酵条件进行了优化研究。研究结果表明,最佳发酵条件为:250mL三角瓶装液量为55mL,转速为165rpm,培养温度为30℃,初始pH 6.8,接种量为7%。花生饼粉,可溶淀粉,氯化钠,酵母抽提物和硫酸铵是发酵培养基最重要的组成因子;最佳培养基配方为:花生饼粉4.88%,可溶淀粉4.40%,氯化钠0.52%,酵母抽提物0.47%,硫酸铵0.0360%。深层发酵结果表明,随着培养基糖量减低,代谢产物总含糖量随之降低,氨基氮含量也随之下降。4明确了拮抗菌发酵液的理化性质:发酵液在不同对酸、碱、温度、紫外线和光照条件下活性稳定。开展了活性成分分离、纯化技术研究。溶剂萃取结果表明,最佳萃取溶剂是乙酸乙酯,萃取物抑菌圈直径达52mm。发酵液通过萃取、硅胶柱层析进行分离纯化,通过气质联用对不同活性组分进行了结构鉴定。鉴定结果表明,乙酸乙酯萃取部分共得到27个化合物,大部分为芳香族的衍生物。其中二十烷(C20H42)和酞酸二丁酯(C16H22O4)是主要活性组分,关于两种组分有抗真菌活性已有相关文献报道。此外,吗啡烷、7,8-二脱氢-4、5-环氧树脂-17-甲基-3、6-(三甲基硅烷基)氧、十六甲基环八硅氧烷、十八甲基环九硅氧烷、苯甲酸等也是活性组分主要物质。5.本文对乙酸乙酯萃取物对烟草靶斑病菌的作用机理进行了研究,结果表明,当萃取物浓度从1×10-4 mM增加到7×10-4 mM时,活性组分对菌丝生长抑制率达96%,菌核形成受到抑制,菌核形成从71.73%减少至0%,病害防效从88.22%上升到97%。激光共聚焦显微镜分析进一步表明,抗真菌组分能有效抑制担孢子的形成。透射电子显微镜分析发现抗真菌组分能有效抑制菌丝生长,共聚焦激光扫描显微镜结果显示,内源性ROS生成能导致病原菌氧化损伤。本研究首次研究了活性组分对立枯丝核菌的作用机制。6.将乙酸乙酯萃取物处理烟草,通过液相二级质谱对烟草叶片的新陈代谢足迹进行了测定,以未用萃取物处理为对照。结果显示,萃取物能够诱导外源活性氧迸发导致烟草提高免疫能力从而保护寄主。另外,萃取物还能够通过改变烟草叶片的代谢以达到提高寄主抗病能力。代谢组学研究结果显示,烟草经过处理后,能够产生氨基酸(L-半胱氨酸,N,S二(三氟乙酰基)三甲基酯)、哺乳动物类固醇(5α-雄烷-3α,17β二元醇),黄酮类物质(芦丁),胺和氨化物等物质,证明活性组分能改变烟草叶片的代谢从而提高烟草的抗病能力。