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目的:本实验以人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,旨在探讨辽东楤木叶总皂苷联合5-氟尿嘧啶在体内外对人乳腺MCF-7细胞是否具有协同增效作用,并进一步探讨作用的可能机制,为两药联合对乳腺癌的临床治疗提供理论依据。实验方法:1.采用MTT体外增殖法研究不同浓度辽东楤木总皂苷、5-氟尿嘧啶单用及联合作用于人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用;2.利用光学显微镜观察细胞在辽东楤木叶总皂及5-氟尿嘧啶作用于人乳腺癌细胞MCF-7后引起的细胞形态学改变;3.利用Hoechst 3 3 258荧光染色法观察细胞在辽东楤木叶总皂苷及5-氟尿嘧啶作用于人乳腺癌细胞MCF-7后引起的细胞核形态学变化;4.流式细胞仪分析辽东楤木叶总皂苷及5-氟尿嘧啶作用于人乳腺癌细胞MCF-7后引起的细胞凋亡率的变化情况;5.ELISA试剂盒检测辽东楤木叶总皂苷及5-氟尿嘧啶作用于人乳腺癌细胞MCF-7后引起的培养上清液中细胞因子VEGF及TAF的改变;6.Western blot法检测辽东楤木叶总皂苷及5-氟尿嘧啶作用于人乳腺癌细胞MCF-7后凋亡蛋白caspase-3及caspase-7的变化情况;7.建立裸鼠移植瘤模型,观察辽东楤木叶总皂苷及5-氟尿嘧啶单独及联合使用对乳腺癌细胞的生长抑制作用;8.HE染色观察辽东楤木叶总皂苷与5-氟尿嘧啶单独及联合作用于裸鼠后移植瘤的病理切片结果变化情况;9.ELISA试剂盒检测辽东楤木叶总皂苷及5-氟尿嘧啶单独及联合作用于裸鼠后血清中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ、TGF-β及VEGF的变化情况。实验结果:1.MTT体外增殖实验检测结果显示:辽东楤木叶总皂苷与5-氟尿嘧啶单用对乳腺癌细胞MCF-7具有增长抑制作用,细胞的抑制作用随药物浓度提高而增强,呈浓度依赖性,并且联合用药具有协同作用;2.光学显微镜下观察MCF-7细胞:可见空白对照组MCF-7细胞生长旺盛,轮廓清晰。辽东楤木叶总皂苷组细胞皱缩,折光性减弱,5-氟尿嘧啶组细胞变圆形,贴壁不紧密,有漂浮细胞,细胞间隙变大;联合用药组可见大量漂浮细胞及细胞碎片,细胞浆中出现黑点状的小颗粒,出现细胞明显凋亡迹象;3、通过荧光显微镜下观察药物处理后的MCF-7细胞核形态结果提示:未加药物的对照组,细胞核形态圆润,呈现弥散均匀的淡蓝色荧光。辽东楤木叶总皂苷和5氟尿嘧啶单独处理组和联合处理组MCF-7细胞的细胞核或细胞质内有浓染致密的颗粒块状荧光,细胞核固缩、碎裂,说明细胞核中的染色质发生了形态学变化,呈现出典型的细胞凋亡特征;4.流式细胞术结果显示:辽东楤木叶总皂苷、5-氟尿嘧啶联合应用组与单独用药组相比细胞凋亡率明显提高,并将凋亡提前到凋亡早期,差异有统计学意义,提示联合用药促凋亡作用强于单独用药;5.ELISA检测结果显示,辽东楤木叶总皂苷与5-氟尿嘧啶单独及联合作用后细胞培养上清中VEGF及TAF的含量均下降,联合用药组下降显著(p<0.05);6.Western blot法检测caspase-3及caspase-7蛋白表达结果提示:与空白对照组相比,辽东楤木叶总皂苷与5-氟尿嘧啶单独及联合用药组蛋白表达均下调,联合用药组下调显著;7.体内实验显示辽东楤木叶总皂苷组、5-氟尿嘧啶组及两药联合组对MCF-7裸鼠移植瘤生长抑制率分别是29.01%、16.79%和63.36%,辽东楤木叶总皂苷与5-氟尿嘧啶联合组较单一治疗组可更明显抑制肿瘤细胞生长(p<0.05);8.肿瘤组织病理切片进行HE染色,光镜下观察结果显示:空白组细胞排列紧密,瘤细胞以圆形或椭圆形为主,胞核较大。辽东楤木叶总皂苷、5氟尿嘧啶及两药联合组癌细胞大小不均匀,出现水变性,核固缩、溶解及癌细胞崩解,肿瘤组织退变,辽东楤木叶总皂苷组坏死严重;联合用药组凋亡显著。9.ELISA检测结果显示:辽东楤木叶总皂苷和5-氟尿嘧啶单独及联合作用的两批移植瘤模型裸鼠血清中,与空白对照组相比单独及联合用药组TNF-α和IFN-γ的含量均增高,IL-2、TGF-β及VEGF的含量均下降,且联合用药组显著。结论1、辽东楤木叶总皂苷和5-氟尿嘧啶联合使用对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制有协同作用,而且呈现浓度依赖性。2、辽东楤木叶总皂苷和5-氟尿嘧啶联合使用可以提高凋亡率,并将凋亡提前到早期,其凋亡机制可能是通过下调VEGF及TAF表达实现的。两药联合比单独使用能更大程度的影响凋亡相关蛋白的表达,活化caspase-3和caspase-7,产生更强程度的凋亡。3、辽东楤木叶总皂苷和5-氟尿嘧啶联合使用在体内人乳腺癌移植瘤动物模型上也表现出了协同作用,可以减慢肿瘤生长并促进肿瘤内部坏死,同时影响血清内IL-2、TNF-α、IFN-γ、TGF-β及VEGF等细胞因子的表达。