本研究有两个主要目的,首先研究HIV-1整合酶通过一定修饰后,在人类基因组上定向整合的能力,为后续的HIV-1整合位点偏好性研究提供实验依据；其次使用支持向量机(Support Vector Machine, SVM)的方法,通过对已知HIV-1整合酶的整合位点附近DNA序列的学习,建立一个能够有效预测整合位点的生物信息学模型。实验方法1.为了研究HIV-1整合酶的定向整合功能,我们对野生型HIV-1整合酶引入S119D突变,然后使其与多锌指蛋白E2C融合。该融合蛋白能够特异性地识别人类基因组上的特定DNA序列位点。融合蛋白通过反式包装(in trans)进入HIV-1病毒载体,感染细胞后,依次使用生物素引物标记、磁珠富集以及接头介导PCR等方法,对HIV-1整合酶S119D/E2C融合蛋白定向整合位点附近的DNA进行富集和扩增,最终用454测序获得全基因组上的整合位点信息。2.为了解决上述实测整合位点实验周期长的弊端,我们对基因组综述序列(Genome Survey Sequences)数据库中已有的HIV-1整合位点序列进行了整理,提取最可靠的基因组单一匹配序列作为训练数据集。根据支持向量机的算法,使用LibSVM、Matlab和自编的Perl脚本程序对训练数据集进行学习、训练,以建立准确率较高的预测模型,并用于进一步分析。期望通过该模型对HIV-1整合位点序列的预测,获得HIV-1整合酶修饰特征与定向整合能力间相关性评估数据,用于指导设计更优化的实测性研究。结果1.首先,通过实验证明了在对HIV-1整合酶的修饰并反式包装进入病毒的过程中,病毒的包装和感染能力没有明显下降,提示其仍保持作为载体的生物学特征。其次,使用包含不同融合酶及其突变体和融合蛋白的病毒对HEK293T细胞系进行感染,提取、扩增整合位点序列,进而使用454测序法对相应整合位点的分析表明：与野生型整合酶相比,整合酶和E2C融合蛋白在基因组上更倾向在"e2c位点”附近发生整合反应,提示达到了提高在基因组定向整合的能力的预期目标；整合酶S119D突变体降低了HIV-1整合位点处对序列的选择性,提示其随机性插入偏好性可由此得到适当的控制。2.通过支持向量机的统计学习方法建立了对HIV-1整合位点的预测模型,其预测准确率达到了82.09%(AUC=0.8678)。具体的建模过程表明,支持向量机在整合位点预测过程中,训练数据集需要的整合位点数最少在500～1000个。该模型的预测结果,与实验得到的HIV整合位点序列的特征基本一致。我们不仅预测到整合反应偏好的序列,还预测到一些整合反应最不偏好的序列,并分别命名为热点序列和冰点序列。冰点序列目前尚无法通过实验手段得到。结论在宏观水平上,借助多锌指蛋白E2C特异性结合DNA的功能,一定程度上实现HIV-1载体向人类基因组上特定位点的定向整合；在微观水平上,整合酶的S119D突变降低了整合位点DNA序列上的偏好性。这两个层次的特点在解决HIV-1对基因组整合位点的选择和可控性上提供了有益的借鉴。使用支持向量机建立起相应的预测模型,为相关实验的前期设计和分析提供有效的信息,可以有效地克服现有实验技术和工具的局限性。