背景:神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是一种常见的慢性疼痛。在临床很多病人常常表现为自发痛、异常性疼痛、诱发痛、痛觉过敏、痛觉超敏。严重影响患者的生存及生活质量。然而目前针对这种慢性神经痛疾病尚无有效的治疗手段。因此,研究神经病理性痛的发病机制对于获取更为有效的治疗措施,对改善患者生存质量,降低医疗成本,具有重要的意义。瞬时反应通道(TRP)在神经病理性疼痛中起重要作用。此外脊髓水平胶质细胞的激活引起的炎性反应以及神经损伤后由外周产生的促炎性细胞因子IL-lβ、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)等都在中枢神经系统的敏化中起着重要作用。近年来中药在镇痛方面的研究广为报道,其中多种中药在抑制神经病理性疼痛方面的效果显著,但机制不详。本研究拟通过制备pSNL诱导的大鼠神经病理性疼痛模型,多途径探讨葛根素对神经病理性疼痛大鼠的确切镇痛作用及对疼痛相关信号通路的调控及具体的镇痛分子机制,为葛根素更好的应用于临床提供理论基础,为更好的防治神经病理性疼痛提供新的策略。第一部分葛根素对pSNL神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及对大鼠自主活动的影响目的:探讨葛根素(puerarin)对pSNL神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用方法:SPF级成年雄性SD大鼠40只,体重180-210g,随机分为4组(n=10):空白组(C组)、模型组(M组)、葛根素低剂量(30mg/kg)组(L组)、葛根素高剂量(60mg/kg)组(H组)。空白组以外的三组采用坐骨神经部分结扎(Partial Sciatic Nerve Ligation,pSNL)建立外周神经痛模型。手术后空白组和模型组连续7天腹腔注射生理盐水。其余两组腹腔给予相应剂量的葛根素:分别于手术前及手术后1-7天检测大鼠机械痛阈值(MWT)及热缩足潜伏期(PWL),期间记录大鼠体重,并于实验第0、3、7天检测的大鼠自主活动能力以及用冷丙酮法检测大鼠的冷痛阈值。行为学实验结束后处死大鼠,取大鼠L4-L6段背根神经节及腰膨大段的脊髓,用于后续的检测。结果:与C组比较,M组大鼠的MWT和PWL明显降低(P<0.05),表明模型己成功建立,而与M组相比,L和H组MWT和PWL明显提高(P<0.05)。提示葛根素可缓解大鼠的机械痛敏和热痛敏行为。M组中大鼠自主活动能力显著下降,而L和H组大鼠相较M组自主活动有所改善(P<0.05)。结论:葛根素可以改善PSNL神经病理性疼痛大鼠的机械痛敏、冷痛敏和热痛敏,还可以在一定程度上改善大鼠的自主活动能力。第二部分葛根素对神经病理性疼痛大鼠TRPV1/TRPA1、蛋白表达的影响目的:探讨葛根素(puerarin)对神经病理性疼痛大鼠TRPV1/TRPA1蛋白是否有影响。方法:最后一次行为学实验结束后,取各组大鼠L4-L6段背根神经节,利用q-PCR和Westemblot技术检测大鼠背根神经节内TRPV1/TRPA1的mRNA和蛋白的含量。结果:与C组比较,M组中TRPV1和TRPA1的mRNA含量明显升高(P<0.05);与M组比较,L和H组中TRPV1和TRPA1的mRNA表达有明显的下调(P<0.05)。与C组比较,M组中TRPV1和TRPA1蛋白表达量明显升高(P<0.05);与M组比较,L和H组中TRPV1及TRPA1蛋白的表达也有明显的下降。结论:葛根素可以改善神经病理性疼痛导致的大鼠TRPA1/TRPV1蛋白及mRNA的表达上调。第三部分葛根素对神经病理性疼痛中大鼠脊髓胶质细胞活化和炎性因子的影响目的:探讨葛根素(puerarin)对神经病理性疼痛大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化的影响以及对脊髓内炎性因子的影响。方法:最后一次行为学结束后,充分暴露脊髓后,取出脊髓,并放入4%多聚甲醛中后固定6～10h(或4℃冰箱内过夜),然后将组织转移到PBS配制的30%蔗糖中脱水沉底(4℃冰箱内,放24 h)。组织沉底后,用OCT包埋剂包埋组织,置于-800C冰箱中保存。用于检测炎性因子的脊髓取下后直接-80℃冰箱冻存。染色前将其切为厚度为4阿的冰冻切片。免疫荧光法检测脊髓小胶质细胞活化标记物Iba-1和星型胶质细胞活化标记物GFAP的含量,用Elisa法检测脊髓内 IL-lβ,IL-6 及 TNF-α 的含量。结果:与C组比较,M组的大鼠脊髓背角处星形胶质细胞活化标志物GFAP蛋白和小胶质细胞活化标志物Iba-1蛋白的表达明显增多,L组和H组均相较于M组有明显的降低(P<0.05)。提示葛根素可以抑制pSNL所致的大鼠脊髓背角处星形胶质细胞和小胶质的活化。与C组比较,M组的大鼠脊髓内IL-lβ,IL-6及TNF-α的含量明显增多,L组和H组均相较于M组有明显的降低(P<0.05),提示葛根素可以降低pSNL所致的大鼠脊髓内炎性因子的释放增多。结论:葛根素可抑制神经病理性疼痛状态下的脊髓小胶质细胞和星型胶质细胞的激活并可抑制脊髓水平的炎性反应。