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第一部分小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤对肝脏m i R一155表达的影响目的：探讨小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤对缺血肝组织miR-155表达的影响。方法：取野生型C57BL/6 (WT)小鼠,将其随机分为两组：假手术组及手术组,每组20只,建立肝脏部分热缺血再灌注损伤模型。假手术组(sham),不阻断肝脏左叶、中叶血流,其余所有操作同手术组;手术组(I/R),阻断肝脏左叶、中叶血流1小时后,松开血管夹,开放血流,进行再灌注。缺血1小时再灌注6小时后,评估小鼠存活率,并采集全血血浆检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草转氨酶(aspertate aminotransferase, AST)水平以评估肝功能和缺血肝脏标本行HE染色,评价肝脏损伤程度,并且根据Suzuki’s标准,将肝脏损伤情况半定量进行统计学分析。通过TaqMan探针对肝组织进行逆转录实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测缺血再灌注损伤对miR-155表达的影响。结果：小鼠缺血1小时再灌注6小时后,两组小鼠存活率均达95%以上,可以达到实验要求。小鼠肝脏经历部分热缺血再灌注损伤后,出现明显的肝功能损害,手术组ALT和AST比假手术组明显升高(P<0.0001)。肝脏损伤病理显示：假手术组,小鼠肝组织结构基本正常,小叶中央静脉,肝细胞索结构清晰,肝脏无淤血,细胞无变性坏死,肝窦排列整齐,未见炎性细胞浸润。手术组小鼠肝脏经历1小时缺血6小时再灌注后,可见肝脏明显淤血,肝细胞索紊乱排列,不同程度的水肿变性和空泡状变,可见大量片状坏死灶,伴有炎性细胞浸润。与假手术组相比,手术组Suzuki’s评分显著增高,差异具有统计学意义(P<0.0001)。与假手术组相比较,手术组小鼠肝脏缺血再灌注后损伤肝脏组织中miR-155的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：我们成功建立了小鼠部分热缺血再灌注损伤模型,缺血再灌注损伤增加肝脏miR-155的表达。第二部分miR-155缺失减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤与Kupffer细胞有关目的：探讨miR-155缺失是否通过调节Kupffer细胞进一步减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤。方法：采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 行 microRNA-155基因敲除(miR-155-/-)小鼠鉴定。将小鼠分为四组：(1)WT小鼠对照组：WT小鼠于手术前24小时尾静脉注射与实验组小鼠等量的磷酸盐缓冲液,(2)miR-155-/-小鼠对照组：miR-155-/-小鼠于手术前24小时尾静脉注射与实验组小鼠等量的磷酸盐缓冲液,(3)WT小鼠实验组：WT小鼠于手术前24小时尾静脉注射GdCl3溶液(10mg/kg), (4) miR-155-/-鼠实验组：miR-1554-/-小鼠于手术前24小时尾静脉注射GdCl3溶液(10 mg/kg)。对各组小鼠进行肝脏部分热缺血再灌注损伤手术,缺血1小时再灌注6小时后,采集全血血浆检测ALT及AST水平以评估肝功能,将缺血肝脏标本行HE染色,评价肝脏损伤程度,并且根据Suzuki’s标准,将肝脏损伤情况半定量进行统计学分析。结果：WT小鼠阳性条带为465bp,miR-155-/-鼠阳性条带为600bp。经尾静脉注射GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠,ALT和AST水平显著低于相应对照组小鼠转氨酶水平,差异具有统计学意义(P<0.0001)。并且,注射GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠的转氨酶水平没有明显差异,差异没有统计学意义(P>0.05)。而注射磷酸盐缓冲液的WT小鼠,ALT和AST水平显著高于注射磷酸盐缓冲液的miR-155-/-小鼠的转氨酶。两实验组肝脏病理学切片与相应的对照组相比,组织损伤明显减弱。WT小鼠对照组术前24小时腹腔注射磷酸盐缓冲液,肝脏经历缺血再灌注后,可见肝脏明显淤血,肝细胞索紊乱排列,不同程度的水肿变性和空泡状变,可见片状坏死,伴有炎性细胞浸润。miR-155-/-小鼠对照组,肝脏损伤较WT小鼠对照组显著减弱,Suzuki’s评分显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组,WT小鼠和miR-155-/-小鼠肝组织结构破坏减少,可见少许灶状坏死及点状细胞变性坏死,大部分的小叶中央静脉及肝细胞索结构尚清晰,肝脏淤血减弱,肝窦排列整齐,炎性细胞浸润明显减少。结论：miR-155缺失通过作用于Kupffer细胞,进一步减轻肝脏部分热缺血再灌注损伤。第三部分miR一155缺失通过调节Kupffer细胞极化减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤目的：探讨miR-155缺失减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤与其调节Kupffer细胞极化的关系。方法：对WT小鼠及miR-155-/-小鼠做肝脏部分热缺血再灌注损伤,缺血1小时再灌注6小时后,采集全血血浆检测ALT及AST水平以评估肝功能,将缺血肝脏标本行HE染色,评价肝脏损伤程度,并且根据Suzuki’s标准,将肝脏损伤情况半定量进行统计学分析。用TUNEL技术,检测组织中肝细胞凋亡的情况。qRT-PC R检测肝组织中炎性因子mRNA表达水平。密度梯度离心法分离小鼠肝脏中Kupffer细胞,流式细胞术检测肝脏缺血再灌注损伤后Kupffer细胞的表型及分型差异。提取WT小鼠及miR-155-/-小鼠腹腔巨噬细胞,并贴壁纯化,将细胞分4组：A组：WT小鼠腹腔巨噬细胞未刺激组,B组：miR-1554-小鼠腹腔巨噬细胞未刺激组,C组：WT小鼠腹腔巨噬细胞+LPS (50ng/ml)刺激24小时, D组：miR-155-/-小鼠腹腔巨噬细胞+LPS(50ng/ml)刺激24小时。收集每组细胞,流式检测腹腔巨噬细胞表型及分型的差异：ELISA检测腹腔巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-10浓度。franswell共培养研究Kupffer细胞和巨噬细胞对肝细胞凋亡的影响。结果：miR-155-/-小鼠组ALT和AST水平明显低于WT小鼠组。肝脏组织病理学切片显示：与WT小鼠组相比,miR-155-/-小鼠组肝脏组织坏死区域明显减小,淤血也较少,肝组织结构破坏明显减弱。WT小鼠组肝组织淤血明显增强,肝细胞索严重破坏,可见多个片状坏死区域。与WT小鼠组相比,miR-155-/-小鼠组Suzuki’s评分显著降低,差异具有统计学意义(P<0.001),并且凋亡的肝脏细胞也显著减少(P<0.05)。缺血再灌注损伤后,两组小鼠肝脏中炎性因子的表达水平均明显升高,miR-155-/-小鼠肝脏TNF-a的表达水平明显低于WT小鼠,而miR-155-/-小鼠肝脏IL-10的表达水平明显高于WT小鼠。肝脏缺血再灌注后,miR-155-/-小鼠组Kupffer细胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达水平明显低于WT组小鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-155-/-小鼠组,M1型(CD11c+ CD206-) Kupffer细胞较WT组明显减少,而M2型(CD11c-CD206+) Kupffer较WT组却明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。分离纯化的腹腔巨噬细胞纯度>90%,可以满足实验需要。无LPS刺激组(PBS孵育组),miR-155-/-小鼠来源的腹腔巨噬细胞CD80、CD86和MHC-1I的表达明显低于WT小鼠来源的巨噬细胞,差异具有统计学意义(CD80 P<0.01; CD86 P<0.05; MHC-ⅡP<0.05)。经LPS刺激后,两种小鼠来源的巨噬细胞CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表达均明显升高,但是,miR-155-/-小鼠来源的腹腔巨噬细胞CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表达水平与WT小鼠组相比明显降低,差异显著(CD80P<0.01; CD86 P<0.05; CD40 P<0.01; MHC-ⅡP<0.05)。无LPS刺激组,miR-1554-小鼠来源的腹腔巨噬细胞M1型(CD11c+CD206-)细胞比例显著低于WT小鼠组(P<0.01),而其M2型(CD11c-CD206’)细胞比例却显著高于WT小鼠组(P<0.05)。经LPS刺激后,两种小鼠来源的巨噬细胞M1型细胞比例均升高,M2型细胞比例均降低。但是,miR-155-/-小鼠组M1型细胞比例明显低于WT小鼠组相比,M2型细胞比例明显高于WT小鼠组,差异具有统计学意义(M1 P<0.05, M2 P<0.01)。LPS刺激后,巨噬细胞培养上清中TNF-α和IL-10浓度均明显升高,miR-155-/-小鼠组巨噬细胞培养上清中TNF-α的浓度明显低于WT小鼠组,而miR-155-/-小鼠组巨噬细胞培养上清中IL-10的浓度明显高于WT小鼠组,差异具有统计学意义(P值均小于0.05)。巨噬细胞和Kupffer细胞加速肝细胞凋亡；miR-155-/-.小鼠来源的Kupffer细胞较WT小鼠来源的Kupffer细胞对肝细胞促凋亡作用明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-155缺失可以通过调节Kupffer细胞,抑制其向M1型分化,而促进其向M2型分化,减少炎性因子TNF-α分泌,而促进IL-10的分泌,减弱肝细胞凋亡及肝脏炎性反应,进一步改善肝脏缺血再灌注损伤。