背景:胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）是2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）的发病机制之一。流行病学资料显示,长期饮酒与胰岛素敏感性之间存在密切的关系。在正常饮食情况下,酒精摄入量与胰岛素敏感性呈反“U”型或反“J”型曲线关系。换言之,不饮酒、少量饮酒或大量饮酒可导致胰岛素抵抗,而适度饮酒则可以增加胰岛素敏感性。在高脂饮食情况下,酒精影响胰岛素敏感性的研究甚少。尽管Wilkes等报道长期饮酒可使摄入高脂饮食的大鼠脂肪细胞发生胰岛素抵抗,但由于类似研究太少,不足以揭示高脂饮食条件下长期饮酒与2型糖尿病发生的关系。随着饮酒的日益普遍及生活方式的逐渐西方化,探讨长期饮酒伴或不伴高脂饮食对胰岛素敏感性的影响及机制就显得愈发重要,因为相关的研究结果必将成为指导人们建立良好生活方式及预防饮食相关疾病的重要依据。近年来研究人员发现,脂肪组织中GLUT4的表达在胰岛素抵抗发生过程中发挥着重要作用。例如,脂肪细胞GLUT4表达缺失（GLUT4-/-）的小鼠在发育过程中出现胰岛素抵抗,而脂肪细胞过表达GLUT4的小鼠胰岛素敏感性显著增强。另一项研究显示,在胰岛素抵抗发生过程中,脂肪组织中GLUT4表达受损早于骨骼肌和肝脏。上述研究表明,脂肪组织中GLUT4表达降低可能是机体胰岛素抵抗发生的决定因素及初始环节。研究发现,GLUT4的表达受到P13K依赖途径及P13K非依赖途径的调节。前者通常指经典的胰岛素信号转导通路,后者如G蛋白通路、Cb1/T10通路等。新的研究发现,AMP活化的蛋白激酶（AMPK）也参与调节GLUT4的表达。在骨骼肌中,活化的AMPK增加GLUT4的表达及转位,而在脂肪组织中AMPK对GLUT4表达调控尚存在争议。除调节糖脂代谢外,AMPK最近还被认为是酒精影响胰岛素敏感性的新靶点。两个研究小组证实饱和脂肪酸与酒精联合应用可以增加新生大鼠心肌细胞及小鼠肝脏中AMPK的活化,从而改善胰岛素敏感性。在脂肪组织中,酒精是否通过作用于AMPK发挥对胰岛素敏感性的调控,目前尚缺乏相关报道。AMPK调节GLUT4表达的机制尚未阐明。Mora &Pessin发现,在骨骼肌中,活化的AMPK通过肌细胞增强子（myocyte enhancer factor 2,MEF2）来刺激GLUT4的表达。MEF2是在骨骼肌分化过程中发挥重要作用的转录因子,自从位于GLUT4启动子上的MEF2结合位点被发现后,MEF2开始被认为是骨骼肌中GLUT4的转录调节因子。在脂肪组织中,AMPK是否也可以通过MEF2调节GLUT4表达,从而影响机体胰岛素敏感性,目前没有相关研究。目的:观察正常饮食及高脂饮食条件下,长期饮酒对机体胰岛素敏感性的影响及相关信号分子的变化;从体内、体外实验两个层面,利用大鼠和人两个种属的成熟脂肪细胞,验证大鼠和人脂肪组织中AMPK/MEF2/GLUT4信号通路的存在,阐述了酒精影响胰岛素敏感性的可能机制。具体探讨了以下问题:1.体内实验:1.1观察长期饮酒对正常饮食和高脂饮食大鼠胰岛素敏感性的影响。1.2观察长期饮酒对脂肪组织中AMPK、MEF2及GLUT4表达的影响。1.3验证活体大鼠脂肪组织中AMPK/MEF2/GLUT4信号通路的存在。2.体外实验:2.1观察体内主要游离脂肪酸-棕榈酸（Palmitic acid,P）存在或不存在时,酒精对AMPK、MEF2及GLUT4表达的影响。2.2验证大鼠和人类成熟脂肪细胞中AMPK/MEF2/GLUT4信号通路的存在。方法:1.体内实验部分:1.1观察长期饮酒对胰岛素敏感性及相关信号分子的影响。1.1.1动物分组及喂养:分组一:雄性Wistar大鼠36只,按体重随机分为3组,每组12只,即对照组(蒸馏水:5g·kg^-1·d^-1,C组);大剂量饮酒组(酒精量5g·kg^-1·d^-1,H组);小剂量饮酒组(酒精量0.5 g·kg^-1·d^-1,L组)。酒精每日一次灌胃给予,喂养时间22周。分组二:雄性Wistar大鼠36只,按体重随机分为3组,每组12只,即正常饮食组(蒸馏水:5g·kg^-1·d^-1,N组);高脂饮食组(蒸馏水总量:5g·kg^-1·d^-1,HF组);高脂饮食加酒精组(酒精总量5g·kg^-1·d^-1,HF+E组)。酒精每日两次灌胃给予,喂养时间22周。1.1.2大鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性的评价:处死前3天行口服糖耐量试验,分别测定空腹血糖及糖负荷后30、60、120分钟血糖,计算糖耐量曲线下面积[1/4BG（0min）+1/2BG（30min）+3/4BG（60min）+1/2BG（120min）],用以评价葡萄糖耐量。处死前抽取空腹血,检测空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、空腹胰岛素（fasting insulin,FINS）,并计算HOMA-IR指数（FPG×FINS/22.5）,用以评价机体水平胰岛素敏感性。1.1.3血浆酒精浓度、血清脂联素及游离脂肪酸的检测:大鼠处死时留取空腹血,干化学法检测血浆酒精浓度。酶联免疫吸附实验（ELISA法）检测血清脂联素（adiponectin）及游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）。1.1.4酒精对脂肪组织中AMPK/MEF2/GLUT4信号转导通路的影响:分离附睾及肾周脂肪组织并称重,用以观察内脏脂肪变化。RT-PCR检测附睾脂肪组织中AMPK的催化亚基AMPKα1和α2、MEF2两个亚型MEF2A和MEF2D以及GLUT4的mRNA水平。Western blot检测总AMPKα（total-AMPKα,T-AMPKα）、磷酸化AMPKα（phosphorylated-AMPKα,pAMPKα）、MEF2以及GLUT4的蛋白表达。免疫荧光检测GLUT4的蛋白水平。1.2验证大鼠脂肪组织中AMPK/MEF2/GLUT4信号通路的存在。正常雄性Wistar大鼠6只,随机分为2组,每组3只,即AICAR组（0.8 mg/g bodyweight）和对照组（注射相应体积的生理盐水）。RT-PCR检测附睾脂肪组织中GLUT4 mRNA水平。Westem blot检测T-AMPKα、pAMPKα、MEF2以及GLUT4的蛋白表达。2.体外实验部分:2.1成熟大鼠和人脂肪细胞的分离:取正常雄性Wistar大鼠的附睾脂肪组织及成年男性的大网膜脂肪组织,小心剔除可见血管,用1mg/ml的胶原酶Ⅰ进行消化,先后经500μm、250μm尼龙筛过滤、800g离心得到成熟脂肪细胞。2.2细胞分组及处理:将细胞重悬后,种到10mm培养皿中,每皿细胞数为1×10⁷。实验分组如下:分组一:N组,正常对照组;A组,1mM AICAR;C组,20μM compound C;A+C组,AICAR与compound C共培养。分组二:N组,正常对照组;E1组,100mM酒精;A组,1mM AICAR;E1+A组,100mM酒精与AICAR共培养。分组三:N组,正常对照组;P组,0.4mM棕榈酸;E2组,20mM酒精;P+E2组,棕榈酸与20mM酒精共培养:C组,20μM compound C;E2+C组,20mM酒精与compound C共培养。处理时间:1小时。2.3 AMPKα、MEF2以及GLUT4的检测:RT-PCR检测脂肪细胞中GLUT4mRNA水平;Western blot检测T-AMPKα、pAMPKα、MEF2以及GLUT4的蛋白表达。结果:1.观察酒精对胰岛素敏感性和脂肪组织中AMPK、MEF2及GLUT4表达的影响。1.1体内实验部分:1.1.1血浆酒精浓度每日一次小剂量灌酒(0.5g·kg^-1·d^-1),血浆酒精浓度为4.4±0.6mg/dl,每同一次大剂量灌酒(5g·kg^-1·d^-1),血浆酒精浓度为87±24.9mg/dl,而每日两次大剂量灌酒(5g·kg^-1·d^-1),血浆酒精浓度则仅为10.8±4.4mg/dl,表明血浆酒精浓度除与摄入酒精的总剂量有关外,还与摄入酒精的频率有关。结合血浆酒精浓度、以往的研究及本研究的结果,我们推测每日一次小剂量灌酒可能模拟了不饮酒或少量饮酒的效应,而在日饮酒总量相同的情况下,每日一次灌酒可能模拟了大量饮酒的效应,而每日两次则模拟了适量饮酒的效应。1.1.2胰岛素敏感性评价:1.1.2.1在正常饮食情况下,酒精喂养22周后,与C组相比,H组和L组大鼠空腹血胰岛素水平分别增加27.6-（P＜0.05）和13.1%（P＞0.05）,HOMA-IR指数分别增加32.3-（P＜0.05）和13.3%（P＞0.05）,表明长期大剂量和小剂量饮酒均可降低机体胰岛素敏感性,大剂量饮酒对胰岛素敏感性的影响尤为明显。1.1.2.2在高脂饮食情况下,与N组相比,HF组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数分别增加28.1-（P＞0.05）、28.3-（P＜0.05）和69.8%（P＜0.01）。而与HF组比较,增加适量酒精摄入使空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数分别下降了7.8-,19.7-和28.2%。上述结果表明,高脂饮食可以诱发机体胰岛素抵抗,而长期适量饮酒能够改善高脂诱导的胰岛素抵抗。1.1.3长期饮酒对大鼠脂肪组织中AMPK、MEF2、GLUT4表达的影响1.1.3.1在正常饮食情况下,长期大量和小量饮酒不影响AMPKα1和AMPKα2亚单位的mRNA水平,同时脂肪组织T-AMPKα的蛋白水平也没有明显改变,但H、L组大鼠脂肪组织中pAMPK的蛋白水平显著降低（P<0.05）,提示长期摄入乙醇可抑制AMPK活化。与pAMPK变化一致,MEF2及GLUT4的转录和翻译也明显受抑,由于AMPK是MEF2的上游分子,而MEF2又是GLUT4的转录调节因子,因此,长期饮酒降低脂肪组织中GLUT4表达的机制很可能是抑制了AMPK的活化,进而使MEF2的表达降低所致。1.1.3.2长期高脂饮食降低大鼠脂肪组织中AMPK的活化,进而引起MEF2及GLUT4 mRNA及蛋白表达减少,而长期适量酒精摄入则可以减轻高脂饮食对AMPK活化及MEF2表达的损害,从而增加GLUT4表达。1.2体外实验部分1.2.1为选择酒精的最适体外作用浓度,我们观察了酒精的量效关系,如下图所示,20mM酒精使成熟大鼠脂肪细胞中AMPK活化增加,而50、100、150mM酒精抑制AMPK活化,并且这种抑制作用随剂量增加而增强。因此在第一部分实验中我们选择100mM（E1）来模拟大量饮酒的效应,第二部分中选择了20mM（E2）来模拟适量饮酒的效应。1.2.2大剂量酒精处理抑制AMPK活化,减少MEF及GLUT4表达:在离体大鼠和人类成熟脂肪细胞中,100mM酒精显著降低AMPK活化及MEF2和GLUT4的表达。体外实验结果证实,酒精可以直接抑制上述分子的表达,而不是继发于其他系统的损害。1.2.3适量酒精处理减轻游离脂肪酸对AMPK、MEF2及GLUT4表达的抑制作用:用棕榈酸处理离体大鼠成熟脂肪细胞后,细胞内AMPK的活化水平、MEF2和GLUT4的表达均显著降低,当与20mM的酒精共培养时,上述分子的表达得到改善,提示适当浓度的酒精可以部分抵消游离脂肪酸对AMPK、MEF2、GLUT4表达的损害。2.验证脂肪组织中AMPK/MEF2/GLUT4信号通路的存在2.1体内实验将AICAR注入大鼠体内可显著增加脂肪组织AMPK的活化,进而使MEF2及GLUT4表达增加,说明活化的AMPK可以正向调节MEF2的表达,从而使GLUT4转录增加,最终导致GLUT4蛋白表达的增加。2.2体外实验在大鼠及人类成熟脂肪细胞中,AICAR激活AMPK后,使MEF2和GLUT4的表达显著增加。然而,如果用AMPK阻断剂——Compound C预处理上述细胞,则观察不到AICAR对MEF2及GLUT4的激活作用,提示在大鼠和人类的脂肪细胞中,MEF2和GLUT4确实受到AMPKα正向调节,即存在AMPKα/MEF2/GLUT4这一信号通路。结论:1、在大鼠和人类成熟脂肪细胞中存在AMPK/MEF2/GLUT4信号转导通路,AMPK正向调节MEF2及GLUT4的表达。2、在正常饮食情况下,长期小量及大量饮酒降低胰岛素敏感性,脂肪组织中AMPK活化受抑,导致MEF2表达减少,引起GLUT4转录及蛋白表达降低是其可能机制之一。3、在高脂饮食情况下,适量酒精摄入明显改善高脂诱导的胰岛素抵抗,这可能与酒精减轻高脂对组织中AMPK/MEF2/GLUT4信号通路的抑制作用有关。