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古菌是与真核生物和细菌并列的第三种生命形式，被认为是真核生物和细菌的嵌合体，其代谢方式类似于细菌而遗传信息的加工则和真核生物类似。古菌大多数生活在高温、高压、极端pH、强离子辐射等极端环境下，其基因组更容易遭受环境的胁迫而产生各种DNA损伤。其中，DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）是生物体最严重的DNA损伤方式之一，若不修复，将引起生物体基因组不稳定，进而导致生物体死亡。同源重组修复是生物体修复DSBs主要方式之一。在细菌中，同源重组修复主要包括RecBCD、RecFOR和SbcC-SbcD途径。在真核生物中，同源重组修复是由Mre11-Rad50介导的，但具体机制尚不清楚。在古菌中，没有发现RecBCD和RecFOR同源蛋白，但存在SbcC/Mre11和SbcD/Rad50同源蛋白，因此古菌中可能存在Mre11-Rad50介导的同源重组修复。Mre11具有3’-5’ ssDNA核酸外切酶和核酸内切酶活性。Rad50是ABC（ATP-binding cassette）型ATPase。在真核生物Mre11-Rad50介导的同源重组修复中，除了Mre11和Rad50外，还有Nbs1（哺乳动物）/Xrs2（酿酒酵母）作为配体，形成MRN/MRX复合体共同参与双链断裂重组修复起始阶段3’-overhang结构的产生过程。而在古菌中，只发现了Mre11和Rad50同源蛋白，没有发现Nbs1/Xrs2配体的同源蛋白。在硫化叶菌Sulfolobus tokodaii及其它许多嗜热古菌基因组中，与Mre11和Rad50同一个操纵子内存在另有两个开放阅读框（ORFs）。研究表明，古菌中的这两个ORF其中一个是核酸酶NurA，另一个是解旋酶HerA。HerA是一种新型的解旋酶，广泛存在于嗜热古菌中。其基因在基因组中的组织形式暗示该解旋酶与其关联蛋白Mre11和Rad50之间可能存在着功能上的联系，但是它们之间的关系目前仍然不清楚。NurA、HerA与Mre11/Rad50是否具有相互作用、相互作用的机制以及它们在双链断裂重组修复中的功能还不清楚。本论文旨在研究解旋酶HerA蛋白的体外生化性质、与Mre11之间的相互作用以及在体内可能参与的代谢过程，以期阐明解旋酶HerA在体内参与的生物学过程和功能，从而为真核生物中Mre11/Rad50介导同源重组修复机制提供启示。
本研究中，我们首先克隆了S.tokodaii中HerA基因，并在大肠杆菌中异源表达和纯化了HerA蛋白（StoHerA）。在用分子筛纯化过程中我们发现StoHerA可以以六聚体或者七聚体的形式存在。ATPase活性检测表明StoHerA蛋白在没有DNA存在的情况下也有很高的活性（平均每个HerA分子每分钟水解约4.25个ATP分子）。同时StoHerA的ATPase活性可以被ssDNA，5’-overhang和钝端双链DNA（blunt-ended DNA）激活，并且更依赖双链DNA，与S.acidocaldarius和Pyrococcus abyssi中的同源蛋白类似；DNA结合实验表明，StoHerA更倾向结合具有次级结构的Holliday junction（HJ）和splayed-arm DNA（Y-型DNA）；解旋酶活性检测发现StoHerA能够高效地解开HJ和splayed-arm DNA底物，也能对钝端双链进行解链，但是解链效率较低。
同时，我们克隆了S.tokodaii中Mre11基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化了StoMre11蛋白，通过pull-down和酵母双杂交的方法，证明了StoHerA和StoMre11之间存在着相互作用，并且HerA的ATPase活性和解旋酶活性可以被Mre11所激活。
另外，我们对HerA的四个保守位点进行了点突变分析，发现位于WalkerA和Walker B保守结构域的K153或E355突变为丙氨酸会导致其ATP酶活性和解旋酶活性丧失，而D175A和R380A定点突变体的ATP酶活性和解旋酶活性则大大减弱。其中，有意思的是位于walkerB保守结构域的E355位点，该位点突变为丙氨酸，不仅导致ATP酶活性和解旋酶活性的丧失，而且也导致DNA结合能力的丧失。
其次，我们利用目前应用较广的两种穿梭载体，基于病毒载体SSV1构建的病毒载体pMJ0503和基于质粒pRN1构建的质粒载体pJ-在古菌S.solfataricus PH1-16中分别表达带有组氨酸标签的StoHerA及其点突变体StoHerA（D175A）蛋白，并利用Ni2+-NTA琼脂糖柱进行纯化，免疫印迹检测及质谱鉴定结果表明野生型StoHerA及其突变体StoHerA（D175A）蛋白在S.solfataricus PH1-16中得到了表达；同时在用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化StoHerA的洗脱液中我们也发现了一些可能与StoHerA结合的蛋白，对SDS-PAGE的蛋白条带进行质谱鉴定，结果表明其中一些蛋白与DNA代谢相关，如核酸酶NurA（SSO2248）、古菌REP家族蛋白（SSO1515）等；另外一些蛋白与糖脂代谢相关，如假想的酯酶（SSO2979），酰基辅酶A合成酶（SSO1806），葡萄糖脱氢酶（SSO3204）和赖氨酰tRNA合成酶（SSO2979）等。对于病毒载体我们也在洗脱液中发现了一些可能结合的蛋白，包括DNA代谢相关蛋白Rep（SSO1515）；信号转导蛋白（SSO0029）；酰基辅酶A代谢相关蛋白酰基辅酶A合成酶（SSO1806）和酰基辅酶A脱氢酶（SSO2877）；糖脂代谢相关蛋白古菌果糖1，6-二磷酸酶（SSO0286），假想的酯酶（SSO2979）以及氨基酸合成相关的赖氨酰tRNA合成酶（SSO2979）等。以上对SDS-PAGE蛋白条带的质谱鉴定结果暗示着StoHerA可能在体内和这些蛋白之间存在着直接或间接的相互作用。
接着我们通过二维双向电泳（2-DE）的方法对洗脱液中的成分进行进一步分离。虽然由于样品选择的原因，洗脱液中的样品通过2-DE分析后我们没有发现HerA蛋白，但是一些DNA损伤相关蛋白如单链结合蛋白SSB（SSO2364）、DNA解旋酶XRCC2/XPD（Ta0057）、ASNC家族RNA聚合酶、转录因子（SSO0606）和TenA家族转录激活子（SSO2089）出现在质粒载体表达系统的样品中。而在病毒载体表达系统中我们发现了ABC转运系统ATP结合蛋白SSO3093，这个结果暗示了StoHerA可能与该系统蛋白相互作用，同时也暗示着StoHerA可能参与了一些物质的转运过程，这个推测需要进一步的证据来证实。
免疫共沉淀的结果显示在HerA过量表达的S.solfataricus PH1-16体内StoHerA和酰基辅酶A合成酶（SSO1806）-块被其兔血清抗体免疫共沉淀下来，说明这两个蛋白可能存在直接或间接的相互作用，这与S.solfataricus PH1-16中StoHerA蛋白的表达时鉴定的结果一致。
遗传分析表明，在S.solfataricus PH1-16表达HerA蛋白的转化子中，阿拉伯糖基因和HerA基因ST2106-块整合到S.solfataricus PH1-16的基因组上。而基因组中插入突变的pyrF基因则可能发生了回复突变或者是与载体上的野生型pyrF基因发生了同源交换。