随着许多生物基因组测序的完成,功能基因组学逐渐成为人们研究的重点。其中,必需基因由于其保守的序列,对细胞功能的核心作用及其作为药物作用靶点的潜能而吸引了研究者更多的注意。但是由于传统的基因敲除方法会引发细胞致死效应,很难实现对必需基因的研究,因此亟需人们开发新的基因功能研究系统。为了满足这一需要,我们构建了两套基于不同原理构建的大肠杆菌(Escherichia coli)条件性基因表达调控系统,本文主要介绍这两套系统各自的原理及其应用。温度敏感(temperature-sensitive,TS)突变体是研究必需基因功能的常用系统。相比于其他系统,TS突变体系统具有快速的反应性、广泛的应用性和高可逆性等优势。在此,我们将温度敏感的蛋白内含肽(TS intein)与大肠杆菌T7蛋白表达系统相结合,构建了一套温度敏感的T7表达系统,从而实现在大肠杆菌中制造目的基因温敏表型菌株的目的。将一个温敏的来源于酿酒酵母VMA(Saccharomyces cerevisiae vacuolar ATPase)基因的蛋白内含肽插入到T7 RNA聚合酶编码基因的Ala 491和Cys 492处。改造后的T7 RNA聚合酶只有在允许温度(18℃)下才可以产生有活性的聚合酶,并起始T7启动子下游基因的转录,产生目的蛋白;而在非允许温度(37℃)下,由于胞内没有目的蛋白的存在,细胞则表现为基因敲除的表型。我们分别用β-半乳糖苷酶基因(lacZ)和四环素基因(tet)验证了系统的有效性。首先我们构建了温度敏感的T7 RNA聚合酶。体外T7 RNA聚合酶活性实验表明Ala 491和Cys 492处的内含肽插入是有效的,内含肽的剪切与否直接调控着T7 RNA聚合酶的活性。外源蛋白表达效率实验表明含有温敏内含肽的T7 RNA聚合酶的活性受到温度控制;低温下,含有温敏聚合酶的菌株可以高效地表达外源蛋白,水平与带有不含内含肽的野生型T7 RNA聚合酶的菌株的蛋白表达水平基本一致。为了研究温敏的T7 RNA聚合酶对目的基因表达的调控是否会使细胞呈现目的基因的温敏表型,我们进行了细胞表型实验;并证实当把目的基因插入T7启动子下游,温敏T7表达系统会使细胞呈现温敏突变体的表型。进一步,我们分析了温敏T7表达系统的调控机制。定量PCR实验表明温敏T7 RNA聚合酶在允许温度下可以高效启动T7启动子下游基因的转录,在胁迫温度下则不能;而大肠杆菌RNA聚合酶在任何情况下都几乎不能启动T7启动子下游基因的转录。也就是说,在温敏T7表达系统中,因大肠杆菌RNA聚合酶识别启动子而产生的背景十分低。Western Blot和酶活性实验则表明,目的蛋白的表达直接与T7 RNA聚合酶的活性相关;含有温敏T7表达系统的菌株可以在允许温度下正常地表达蛋白,而在胁迫温度下则不能。胁迫温度下目的基因的表达终止实验表明当把细胞从允许温度转入胁迫温度后,目的基因的表达可以被迅速终止,胞内几乎检测不多目的蛋白的存在。上述结果充分表明该温敏T7表达系统受到温度的严格控制,可以有效地启动和终止目的基因的转录与表达。因此,利用此系统可以使细胞呈现类似基因温敏突变体的表型。由于没有突变引入目的基因序列中,该系统可以避免以往温敏突变体构建方法的缺陷;它不需要将intein直接插入到目的基因中,避免了位点选择和插入失活等问题,大大减少了工作量;诱导反应与终止速度快,可逆性强,胁迫条件下的背景表达极低;且操作简单易筛选,比以往系统更具有优势。此外,因其较高的低温表达效率,该系统还可以用于低温下外源蛋白表达,特别是一些高温下不稳定或会发生错误折叠的蛋白的表达。同时,它实现了T7 RNA聚合酶和T7表达盒在染色体上的共整合,为基因工程和发酵生产等提供了新思路。这是首例在大肠杆菌中通过温敏内含肽调控聚合酶活性来实现温度控制的基因表达的报道。生物基因组测序的完成为新基因的筛选提供了可能。由于不能制造必需基因的缺失突变体,传统的基因筛选方法在新必需基因的筛选上难于应用。其他条件性基因表达系统由于基因表达“渗漏”等问题,很难达到真正的缺失突变体的效果,也不能应用到新必需基因的鉴定。为了建立有效地筛选必需基因的系统,更为简便地筛选未知必需基因,我们将阿拉伯糖操纵子系统与位点特异性Flp/FRT重组酶系统相结合,构建了一套条件性基因敲除互补系统,实现了基因敲除与互补的同步完成,从而达到从其他生物中筛选未知必需基因的目的。首先将两个FRT序列和标记基因整合到染色体上某个必需基因的两侧;之后,将一个含有阿拉伯糖控制的Flp重组酶基因和组成性表达的目的基因的质粒转化到该修饰菌的细胞中。阿拉伯糖存在时,Flp重组酶会敲除两个FRT位点之间的序列(包括必需基因和标记基因)。此时,由于染色体上的原必需基因已被敲除,只有当位于质粒上的目的基因执行与被敲除基因相同的功能时,大肠杆菌细胞才可以存活。与其他研究方法不同,此系统形成了真正的必需基因的缺失突变体,避免了条件性基因控制的不严紧性。而且在该方法中基因的删除和互补同步完成,既避免了敲除致死效应又大大降低了工作量。我们首先对该系统的效率做了一系列检测。结果表明当该系统中的Flp重组酶基因位于染色体,FRT序列位于质粒上时,只要在含有0.2 %的M63培养基中诱导一小时即可达到100 %的基因敲除率。进一步的系统应用的可行性分析,即lacZ和dnaE基因的模式实验证实质粒上的基因可以被有效地表达;重组酶的活性不会受到下游基因的影响;阿拉伯糖诱导后,染色体上原有基因会被敲除,细胞的表型变化与存活情况均依赖于质粒上的基因拷贝。这说明该系统可以用于未知必需基因的筛选鉴定工作。这是首次将条件性重组酶系统应用到功能未知的必需基因的鉴定。之后,利用该系统,我们从体内和体外分析鉴定了两个来源于肺炎衣原体AR39的核酸酶H的性质。生物信息学分析表明肺炎衣原体AR39中仅含有两个核酸酶H编码基因(CP0654和CP0782);与其它生物中的核酸酶H进行同源性比对分析,发现它们都具有2型核酸酶H的保守结构,但是分别含有核酸酶HII和核酸酶HIII的活性位点。因此,我们将其编码蛋白分别命名为Cpn-RNase HII(CP0654)和Cpn-RNase HIII(CP0782)。为了研究这两个核酸酶H在体内是否具有活性,我们利用条件性基因敲除互补系统研究了它们互补大肠杆菌rnh—缺失突变体的情况。结果表明,Cpn-RNase HII可以互补两种大肠杆菌rnh—缺失突变体(rnhA—和rnhB—),而Cpn-RNase HIII只能互补大肠杆菌rnhA—缺失突变体。这暗示CP0654可能是肺炎衣原体AR39中编码核酸酶H主要基因。进一步我们在体外分析了两种核酸酶H的酶学性质。结果表明可能由于其生存环境所致,两种肺炎衣原体核酸酶H均非热稳定型蛋白。与其他核酸酶H相似,它们在进行酶促反应时均需要二价金属离子(Mg2+或Mn2+),但最适离子浓度有所差别;酶促反应的最适pH值都略偏碱性,但分别为9.0和10.0。对两种肺炎衣原体核酸酶H的底物特异性研究发现Cpn-RNase HII在多个位点上对12 bp RNA/DNA底物进行切割,而Cpn-RNase HIII只在一个位点切割;这与之前发现的其他生物的核酸酶HIII有所不同。而且我们发现,只有Cpn-RNase HII可以切割DNA-RNA-DNA/DNA的嵌合体。根据上述特点,我们认为两种不同性质的核酸酶H在肺炎衣原体AR39中可能承担着不同的生理功能。这是首次实现对肺炎衣原体,甚至衣原体的核酸酶H进行体内和体外的详细研究。总之,上述两套条件性基因表达调控系统利用不同策略实现了对基因表达的条件性控制,为进一步研究基因的功能开拓了新的思路。