【摘 要】
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目的POU4F3蛋白属于POU家族转录因子,已有研究显示Pou4f3基因的靶向缺失将导致小鼠前庭功能障碍和重度耳聋,但具体致病机制尚不清楚。迄今为止,已报道发现的人类POU4F3基因突
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目的POU4F3蛋白属于POU家族转录因子,已有研究显示Pou4f3基因的靶向缺失将导致小鼠前庭功能障碍和重度耳聋,但具体致病机制尚不清楚。迄今为止,已报道发现的人类POU4F3基因突变共有30种,其中进行了详细功能研究、确定为致病突变的只有5种(c.884＿891del8,p.I295fs*5;c.668T>C,p.L223P;c.865C>T,p.L289F;c.593G>A,p.R198H;c.704＿705del,p.T235fs)。本文的研究目的是探究其余POU4F3突变蛋白是否致病。方法本文首先采用结构生物学、细胞生物学和生物化学的方法,提取到了4种尚未进行功能研究的POU4F3突变蛋白(c.665C>T,p.S222L;c.718A>T,p.N540Y;c.841A>G,p.I281V;c.982A>G,p.K328E)。然后利用凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)的原理——DNA如果与蛋白发生结合,由于分子量变大,在非变性的聚丙烯凝胶上电泳,会比游离态DNA移动得慢——和溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)标记DNA的技术,通过与野生型POU4F3蛋白相比较,探究这4种变异型POU4F3蛋白与DNA的亲和力,从而确定该变异型蛋白的转录活性是否受到影响以及该突变是否致病,以帮助进行产前诊断及治疗干预。结果经9%聚丙烯酰胺分离胶(Native gel)跑胶后,与阴性对照组(未加入任何蛋白的DNA样品)的DNA条带位置相比,阳性对照组(野生型POU4F3蛋白-DNA混合物)在同一距离位置几乎见不到DNA条带,其条带位置明显滞后,而实验组(变异型POU4F3蛋白-DNA混合物)跑胶后可见两条清晰的DNA条带,电泳距离与以上两种条带距离十分接近。结论与野生型POU4F3蛋白相比,4种变异型POU4F3蛋白(c.665C>T,p.S222L;c.718A>T,p.N540Y;c.841A>G,p.I281V;c.982A>G,p.K328E)与DNA的亲和力明显下降,提示转录活性受到明显影响,可以确定为致病突变。
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