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立项依据：据2005年国际糖尿病联盟估计，全世界糖尿病患者人数已超过1.94亿，已成为当今全球性重大公共卫生问题。尽管Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病发病机制不同，但胰岛细胞数量不足及功能减退是其发病的关键环节。近年来，经门脉胰岛细胞移植技术已应用于临床，但细胞来源不足及严重的免疫排斥反应等问题限制了此种疗法的广泛应用。以胰岛细胞替代物，重建胰岛分泌系统功能的细胞疗法是治愈糖尿病的理想途径。干细胞作为一类具有极强自我更新及多向分化潜能的细胞，已经成为人们寻找胰岛细胞替代物的新资源，从而解决供体来源不足及免疫排斥反应两大难题，为探索糖尿病的治愈提供新的出路。
目的：构建四氧嘧啶导致的糖尿病动物模型，将体外分离培养的自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)植入体内，检测其能否降低血糖从而改善糖尿病症状，能否归巢到损伤胰腺从而促进其再生修复，初步探讨自体骨髓MSCs移植对糖尿病的影响。
方法：1、骨髓MSCs的培养：密度梯度离心法与贴壁细胞分离法相结合扩增培养犬骨髓MSCs。2、骨髓MSCs的生物学鉴定：倒置显微镜下观察细胞生长及形态，免疫细胞化学染色鉴定细胞表面标记物CD34、CD105、CD106的表达。3、骨髓MSCs的Brdu标记：确定Brdu标记骨髓MSCs的最佳浓度和时间，将P2的骨髓MSCs传代后加入Brdu，放入孵箱继续培养。4、糖尿病犬模型的建立：按80mg/kg一次性经犬四肢表浅静脉注入200mg/ml的四氧嘧啶溶液制备比格犬糖尿病动物模型，以出现典型糖尿病症状，给药后24h血糖升高，48h后空腹血糖大于11.1mmol/L且持续2w维持在高血糖水平为成模标准。5、实验动物分组：18条犬随机分为3组：治疗组8条：糖尿病十经胰腺动脉注入自体骨髓MSCs悬液；对照组6条：糖尿病+经胰腺动脉注入等量的生理盐水；正常组4条：不做处置。6、自体骨髓MSCs的移植：采取手术方式经胰腺动脉注入细胞数量为1.8×10<7>的5ml 骨髓MSCs悬液。7、移植后的检测：1)犬一般状况：实验期间每日密切观察饮食、活动、精神状态、皮毛色泽等方面情况。2)体重变化：各组每周一次称重。3)血糖检测：每周3～4次各组上午九时空腹血糖的测定。4)胰腺组织病理学及Brdu免疫组化分析：分别在移植后第5d、18d、30d随机选取治疗组2例，对照组1例，行胰腺组织的HE染色及Brdu免疫组化染色。
结果：1、骨髓MSCs的培养及鉴定：细胞形态均一，呈纺锤状，克隆性生长，细胞计数待移植的体外扩增培养至P3的骨髓MSCs数量达1.8×10<7>，台盼蓝染色细胞活力达95％以上。CD34呈阴性反应，而CD105和CD106染色阳性细胞在98％以上，说明我们获得了较纯化的增殖力强的骨髓MSCs。2、骨髓MSCs的Brdu标记：以20umol/L孵育 72h为Brdu最佳标记浓度和时间，阳性细胞标记率达到97％以上：而非标记组未见阳性细胞。3、糖尿病犬模型的建立：诱导成功的犬空腹血糖持续2w大于11.1mmol/L，出现多饮、多食、多尿、体重下降，在未使用胰岛素的情况下长期存活，未出现低血糖或严重酮症酸中毒导致死亡的现象。4、移植后的检测：1)犬一般状况：造模后，治疗组与对照组饮食量明显增加，出现懒动、精神萎靡，体毛无光泽逐渐疏松脱落；移植后，治疗组饮食无明显变化，活动力、精神状态明显改善，体毛脱落及干枯现象减轻；对照组较移植前无明显变化；正常组一般状况良好。2)体重变化：造模后，治疗组与对照组体重均明显下降，与正常组间差异均有统计学意义(P<0.05)；移植后，治疗组较对照组体重下降缓慢，但两组间差异无显著性(P>0.05)；正常组体重则持续增加.3)血糖检测：造模后，治疗组与对照组血糖均达到成模标准；移植后，治疗组于第5天血糖明显下降，与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，但至实验结束尚未降至正常水平；对照组始终维持在高血糖水平；正常组始终维持在正常血糖水平。4)胰腺组织HE染色形态学分析：正常组：胰岛数目较多，形态规则，边缘较清晰，大小不一散在分布；对照组：胰岛数目明显较少，体积减小，胰岛形态欠规则，边缘不齐或仅能辨认其轮廓，细胞排列紊乱；治疗组：随时间的延长，胰岛数量、大小、边沿虽较正常胰岛有差异，但较对照组有明显改善。5)胰腺组织Brdu免疫组化分析：治疗组：移植后第5天血糖出现明显下降时，胰腺组织中未见Brdu阳性染色细胞，于移植后第18天胰腺中散在分布少量Brdu阳性染色细胞，多位于导管周围，对照组及正常组未见Brdu阳性染色。
结论：1、采用Percoll密度梯度离心联合细胞贴壁生长特性的分离培养法，经体外扩增至P3，可以得到高纯度高增殖活性的骨髓MSCs。2、骨髓MSCs移植能较快，有效地降低血糖，缓解糖尿病症状，但至实验结束血糖未能恢复正常水平。3、植入的骨髓MSCs可以归巢到糖尿病受损胰腺组织中，散在分布并多位于导管周围，参与再生修复。4、在血糖降低之后骨髓MSCs才定位于损伤胰腺组织中，说明骨髓MSCs在归巢前就对损伤胰腺内环境起到支持及促进的作用。