【摘 要】
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白术（Atractylodes macrocephala Koidz）是菊科（Asteraceae）苍术属（Atractylodes DC）的重要药用植物,在我国有着悠久的入药历史,近年来更是成为我国出口创汇的十大拳头中药品种之一,随着白术种植规模的不断扩大,白术的病毒病害也日渐加重,本课题组在对白术病毒病害调查的过程中,从白术病样中分离出大豆花叶病毒,并将该分离物命名为SMV-Am。然而,大豆花
【基金项目】
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《国家自然科学基金》（NO.31772130）；
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白术（Atractylodes macrocephala Koidz）是菊科（Asteraceae）苍术属（Atractylodes DC）的重要药用植物,在我国有着悠久的入药历史,近年来更是成为我国出口创汇的十大拳头中药品种之一,随着白术种植规模的不断扩大,白术的病毒病害也日渐加重,本课题组在对白术病毒病害调查的过程中,从白术病样中分离出大豆花叶病毒,并将该分离物命名为SMV-Am。然而,大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）作为马铃薯Y病毒属（potyviridae）最典型的成员之一,SMV的特征之一便是自然寄主范围十分窄,主要侵染以大豆为主的豆科植物,并且在现有的诸多研究中,尚未出现SMV跨科侵染白术的相关报道。目前关于SMV跨科侵染的报道十分有限,相关的机制研究更是空白。因此,本试验以寄主范围较窄且无法侵染白术的SMV山西大豆分离物SMV-SX和白术中分离所得SMV-Am为材料进行研究。首先利用生信分析软件对SMV-Am的基因组进行分析,之后使用Gibson组装技术构建SMV-Am侵染性克隆p SMV-Am。在验证p SMV-Am的侵染性后,将SMV-SX和SMV-Am的基因组对应片段互相替换,构建一系列突杂合病毒侵染性克隆,比较这些杂合病毒的致病性,从而对SMV-Am跨科侵染机制进行初步的确定。经过研究,得到以下结果:1.将SMV-Am与Gen Bank中获得的100个SMV分离物进行核苷酸与氨基酸序列相似性分析,结果表明SMV-Am与来自中国的SMV-Liaoning分离物相似性最高,且系统进化分析也显示二者的亲缘关系最近;对SMV-Am蛋白序列进一步分析发现,SMV-Am与大部分SMV分离物相比,存在与功能位点相关的氨基酸突变,经I-TASSER和Py MOL软件进行蛋白建模分析,发现SMV-Am的P1、HC-Pro、P3、6K2、NIa-Pro、NIb蛋白结构均发生不同程度的变化,且P1蛋白最明显;重组分析结果显示在SMV-Am基因组的6560-8950nt位置存在重组事件,涉及到NIa-Pro、NIb和CP蛋白,重组事件的主要亲本和次要亲本分别为SMV-XFQ012（Gen Bank登录号:KP710875.1）和SMV-p CB301-SC15（Gen Bank登录号:MH919386.1）。2.利用Gibson组装技术将所得的SMV-Am全基因组的DNA片段连接至穿梭载体p Green II-35S的启动子下游,构建出在农杆菌中也可以成功复制的SMV-Am质粒,避免SMV在大肠杆菌中因为毒性等原因无法复制的问题。通过农杆菌浸润的方法将所得克隆质粒接种于白术和本氏烟,培养一段时间后发现两种植物上均表现出SMV侵染后的症状,两种植物系统叶的RT-PCR检测结果也证明SMV-Am可以成功侵染,因此可以确定SMV-Am的侵染性克隆构建成功。并且证明本氏烟可以作为寄主进行后续试验。3.基于SMV-Am和SMV-SX两分离物的寄主范围存在差异这一特性,将两分离物基因组分成对应的3个部分,分别互换对应区域,共构建3对杂合病毒的侵染性克隆。通过比较它们对本氏烟的侵染情况,发现含有CI和6K2蛋白的3556-6160 bp片段互换后的杂合病毒SMV-Am（3-6）和SMV-SX（3-6）,以及含有NIa-Vpg、NIa-Pro和NIb蛋白的6160-3’片段互换后的杂合病毒SMV-Am（6-3’）和SMV-SX（6-3’）的致病性都出现不同程度的变化,由此初步判断CI、6K2、NIa-Vpg、NIa-Pro和NIb蛋白中存在造成两个SMV分离物致病性出现差异的蛋白质。对以上蛋白的结构预测结果显示,两分离物中对应蛋白的整体空间结构相似,二级结构出现不同程度的变化,并且对这5个蛋白的功能位点进行分析,发现CI、6K2、NIa-Pro与NIb蛋白质中有7个功能位点处的氨基酸存在差异。
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