研究背景：青光眼滤过术后纤维组织增生引起瘢痕粘连导致滤过泡瘢痕化是青光眼手术失败的最主要原因。基于小梁切除术后滤过泡瘢痕化的病理生理特点,近年来国内外专家们采用复合式小梁切除术以减少滤过道瘢痕形成,显著减少了并发症,提高了手术成功率。该技术包括：改进手术方式和技巧,引入非穿透小梁切除术,在术中外置可拆除巩膜缝线,术后控制性定量拆除或激光松解巩膜缝线；术中术后使用抑制瘢痕形成的药物；术中使用植入物。非穿透小梁切除术是是20世纪80年代开始兴起的手术,它在巩膜表层下作深层巩膜、Schlemm管外壁、前小梁和狄氏膜前的角膜基质切除,保留自然的小梁狄氏膜作为滤过层,并在巩膜层间植入透明质酸钠生物胶,使房水通畅外渗的同时有一些阻力,在眼压逐步降低时保持眼球完整性,由此建立一个巩膜内空间,使房水在巩膜腔中经不同流出通道进行引流。该手术优点在于：手术并发症相对较低,视力恢复较快；术后炎症反应较轻；滤过泡更加弥散及扁平；眼内炎的发生率较低。目前临床应用较多的预防瘢痕形成的药物只有5-Fu和丝裂霉素C(MMC)。丝裂霉素C是使用最早抗代谢药物之一,抗增殖作用很强,约为同剂量5-Fu的100倍,可明显抑制成纤维细胞增殖,延缓术后伤口瘢痕愈合的过程,且并发症发生率低于5-FU,可提高预后较差眼的青光眼手术成功率,其效果已经临床和询证医学验证。临床常在术中用MMC0.2～0.4mg/ml的棉片置于巩膜瓣、结膜瓣下2-5分钟,然后用生理盐水冲洗。但局部单独一次性给药方式远期易形成包裹性无功能滤过泡,导致手术失败。青光眼滤过手术研究的主要方向之一就是植入材料的改进。现有的术中植入物有包括透明质酸钠凝胶、生物膜、晶体前囊膜、胶原膜、自体巩膜条等,可机械隔离巩膜瓣和巩膜床,避免或减少纤维粘连,保持滤过道通畅。现在常用的透明质酸钠凝胶和胶原的生物降解期大约只有3-6个月。当植入物降解过程中,非穿透部分的滤过膜表面会逐渐发生纤维增殖而变厚。从而房水的滤过效果可能受到影响,减压室也常常会因纤维增殖而逐渐减小,甚至完全消失。羊膜、巩膜条等植入物可能引起免疫排斥反应等副作用。而透明质酸钠凝胶则因来源受限、价格昂贵而难以普及。因此我们考虑植入材料的改进。在材料的改进上应该选择成型性好、生物相容性良好、眼内降解缓慢、且具有一定的抑制成纤维细胞生长作用的生物材料。壳聚糖是一种良好的可降解的天然生物材料,具有良好的组织相容性,且具有止血和抑菌作用,可调节免疫功能、促进组织修复、抑制结缔组织增生、减少瘢痕粘连等作用。同时它也是一类重要的控制释放给药系统,临床上广泛用于预防骨关节、腹腔术后粘连,可作为眼科粘弹剂使用,具有广泛的应用前景。基于以上研究基础和文献复习,我们希望在植入物中整合抗纤维化药物,即研制良好组织相容性的嵌合式丝裂霉素C壳聚糖的缓释海绵,进行体外及体内动物实验研究,从而达到有效地抑制成纤维细胞的增生,减少滤过泡的瘢痕形成,提高青光眼手术成功率。第一章嵌合式丝裂霉素壳聚糖缓释海绵的制备目的：通过制剂学手段将药物和材料结合起来,制备性质稳定的嵌合式丝裂霉素壳聚糖缓释海绵。方法：(1)选用高脱乙酰度的壳聚糖为基本原料同时复合医用几丁糖通过冷冻干燥,制备壳聚糖海绵；(2)采用二次冷冻干燥技术将两种材料进行嵌合,制备不同浓度的丝裂霉素壳聚糖缓释海绵(MMC-SPCM),使制品的孔隙率更大,孔径更小,更利于药物的填充和负载；(3)采用SD大鼠体内植入MMC-SPCM,测定其组织相容性和体内降解性。统计学处理：使用SPSS13软件,对海绵干、湿态厚度进行分析,采用单因素方差LSD’法进行组间两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。结果：(1)制备不同浓度的新型嵌合式丝裂霉素C的载药缓释海绵；海绵干湿态厚度比较,P干态=0.593,P湿态=0.2033,各组间均没有显著性差异(P>0.01)；(2)检测载药海绵有效地体外缓释的药物释放量；(3)载药海绵在大鼠体内无毒副作用,体内吸收时间3月以上。结论：(1)成功制备不同浓度的新型嵌合式丝裂霉素C的载药缓释海绵；(2)嵌合式丝裂霉素C的载药缓释海绵具有良好的生物相容性及生物降解性,为其作为体内植入材料提供了理论依据。第二章丝裂霉素缓释海绵促进成纤维细胞凋亡体外实验研究目的：确认MMC-SPCM中丝裂霉素的生物学活性,体外验证该控释系统可以促进成纤维细胞凋亡；同时探索最低有效抑制成纤维细胞增殖的较低丝裂霉素浓度。方法：(1)采用组织块贴壁培养法,培养原代人Tenon’s囊成纤维细胞；(2)收集稳定传代4-6代的人Tenon’s囊成纤维细胞,将其分为四组：A组--丝裂霉素缓释海绵组(MMC-SPCM组)、B组--单纯丝裂霉素组(MMC组)、C组--壳聚糖海绵组(SPCM组)和D组--磷酸盐缓冲液组为空白对照组(PBS组)。在MMC-SPCM组中加入2.5mm*5mm大小的丝裂霉素缓释海绵,其中含有MMC含量分别为250、100、50、25、组加入不同浓度的丝裂霉素(MMC浓度分别为250、100、50、25、组中加入2.5mm*5mm大小的壳聚糖海绵；PBS组设空白对照组；用CCK-8法检测对人Tenon’s囊成纤维细胞的生长抑制作用；(3)显微镜观察细胞形态、数量并照相；(4)采用碘化丙啶(PI)染色法,流式细胞仪测定细胞凋亡。统计学处理：使用SPSS13软件,对5种不同浓度和4个处理组数据进行方差分析。应用LSD法进行组件两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。结果：(1)成功培养原代人Tenon’s囊成纤维细胞,并经免疫荧光证实；(2)随着样品中MMC的浓度增加,细胞生长抑制率逐渐升高。浓度25μg/ml即对细胞生长有抑制作用,并且浓度为50μg/ml的MMC-SPCM组与100μg/ml的MMC组抑制率分别为77.48%和76.18%,两者抑制率相当；(3) MMC-SPCM影响人Tenon’s囊成纤维细胞的形态,使正常细胞形状改变,细胞数减少,凋亡和坏死细胞增多；(4)通过流式细胞仪进行细胞周期分析发现,丝裂霉素浓度较高时,人Tenon’s囊成纤维细胞凋亡率明显增加。浓度为50μg/ml的MMC-SPCM细胞死亡与凋亡比例适当。结论：(1)成功培养人Tenon’s囊成纤维细胞。(2)验证了我们所制备的丝裂霉素壳聚糖缓释海绵中丝裂霉素的活性正常,能够促进成纤维细胞的凋亡、抑制成纤维细胞的增殖。(3)利用CCK-8法和流式细胞仪考察和比较了不同浓度丝裂霉素C对凋亡率的影响,结果表明较低浓度(25μg/ml)的丝裂霉素壳聚糖缓释海绵仍然具有抑制人Tenon’s囊成纤维细胞增殖的作用,说明其具有缓释作用。(4)筛选出浓度为50μg/ml的4MC-SPCM为有效抑制成纤维细胞增生的最佳浓度。为下一步体内实验将丝裂霉素壳聚糖缓释海绵应用于动物实验研究其在抗青光眼术后粘连奠定了基础。第三章丝裂霉素缓释海绵预防青光眼术后瘢痕化的体内实验研究目的：通过动物实验,观察研究丝裂霉素缓释海绵对预防兔眼青光眼术后瘢痕化的有效作用,从基因水平证明了丝裂霉素壳聚糖缓释海绵的有效性。方法：(1)30只新西兰兔随机分为3组,每组10只,右眼为实验组行非穿透小梁手术。A组为生理盐水组(NS组),仅作非穿透小梁手术,瓣下注入生理盐水；B组植入SPCM组；C组植入MMC-SPCM组。(2)分别在术后1天、3天、5天、1周、2周、4周、8周、12周观察结膜充血等一般情况、滤过泡高度和面积、眼压变化(每组6只)。(3)分别于术后10d和28d将兔处死(每组2只),3月时处死18只。分别行HE染色和免疫组化染色,观察其病理改变。(4)分别于术后10d将兔处死(每组2只),荧光实时定量PCR,检测三组VEGF和TGF-β2的]mRNA水平。统计学处理：使用SPSS13软件,对不同时间段3个处理组的眼压、滤过泡面积和高度数据进行统计分析。采用方差分析(ANOVA)对不同时间段3个处理组间的差异进行分析,并采用LSD法或Dunnett T3法进行组间两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。结果：(1)术后裂隙灯下观察术眼结膜、角膜、前房等眼前节一般情况,三组无明显差异；(2)术后滤过泡大小和高度变化,随着术后时间延长,逐渐变小、消失。21天时NS组滤过泡完全消失。方差分析三组组间两两比较术后滤过泡情况,滤过泡高度变化：14d时NS组与SPCM组比较,P=0.015,P<0.05有显著差异,NS组与MMC-SPCM组比较,P<0.001,有显著差异；28-84d时,三组组间两两比较,P<0.001,有显著差异。滤过泡面积变化：14d时NS组与SPCM组比较,P=0.002,有显著差异；NS组与MMC-SPCM组比较,P<0.001,有显著差异；28d时,NS组与SPCM组和MMC-SPCM组比较,P<0.001,有显著差异；56-84d时,三组组间两两比较,P<0.001,有显著差异。(3)术后眼压变化,术后3d,NS组分别与SPCM组和MMC-SPCM组比较,P<0.001,眼压变化有显著差异；术后5-84d,三组组间P<0.001,三组组间两两比较眼压值变化都有显著性差异。MMC-SPCM组3月时仍能维持较低眼压；(4)组织病理学改变：术后10d时,NS组结膜、结膜下及滤过道区域可见到大量炎性细胞浸润,以中性粒细胞为主,血管明显充血扩张,并可见到新生血管和成纤维细胞。滤过道区域的炎性细胞较前明显减少,胶原排列较前紧密,成纤维细胞较前增多。MMC-SPCM组,可见壳聚糖海绵,炎性细胞和成纤维细胞最少,SPCM组介于两者之间。术后28d,NS组大量胶原纤维增生,排列致密,滤过道基本堵塞。MMC-SPCM组,仍可见胶原纤维疏松和滤过道存在,膜片残留。术后3月,MMC-SPCM组,仍可见胶原纤维疏松和滤过道存在。(5)荧光定量PCR结果显示MMC-SPCM组的VEGF和TGF-β2的mRNA水平均远远低于NS组和SPCM组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论：(1)成功建立兔眼青光眼非穿透小梁手术模型。(2)通过观察术后兔眼前节一般情况无异常,表明局部应用丝裂霉素缓释海绵对眼内组织无明显毒副作用,组织相容性良好。(3)通过观察术后眼压、滤过泡的改变和病理组织学检查结果,表明应用MMC-SPCM能有效预防青光眼术后滤过道瘢痕粘连。(4)荧光定量PCR结果显示,MMC缓释海绵组通过明显抑制手术部位的VEGF和TGF-β2的mRNA水平来抑制成纤维细胞生长,从基因水平证明了MMC-SPCM的有效性。