新生儿缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是新生儿期脑损伤最为常见的疾病，是引起新生儿死亡、影响新生儿正常发育、导致儿童脑瘫、精神发育迟滞、学习障碍和癫痫等神经系统伤残的主要原因。本病发病率较高，推测国内每年约有750000新生儿发生窒息，约有25万婴儿因而成为伤残儿和/或低智儿童(韩玉昆，1995)。尽管围产医学和对HIBD发病机制研究均取得很大发展，临床上仍以对症支持综合治疗为主而缺少特异性的有效手段。因此为新生儿缺氧缺血脑损伤寻找新的治疗途径十分必要。 细胞移植和基因治疗已成为治疗中枢神经系统损伤和退行性变的最有潜力的手段之一。然而这两种治疗方法目前仍存在许多有待解决的问题。传统的细胞移植物来源于人的胎脑、胚胎神经组织和神经干细胞，这些移植物虽然可以定向分化为各类神经细胞而发挥替代作用，但因取材困难、涉及伦理学争议及免疫排斥等问题限制了应用的空间(Bjorklund，2000)。基因治疗的一些载体如腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒也同样存在使用的安全性、免疫排斥等问题(Somia，2001)。因此，选用何种细胞做为移植来源和基因载体是能否用于临床的关键所在。 间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，起源于中胚层，主要位于成体骨髓，在脐血和外周血中也有少量的MSCs存在(Erice，2000；Goodwin，2004；Jeong，2004；Fernandez，1997)。MSCs具有强大的增殖能力，在体外长期培养过程中可以始终保持其多向分化潜能，在特定条件诱导下可以分化为各种组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、成肌腱、成肌细胞、脂肪细胞和神经细胞(Owen,1998；Young，1998；Wakitani，1995；Dennis，1996；Azizi，1998；Kopen，1999；Sanchez-Ramos，2000；Brazelton，2000；Woodbury,2000)。已有实验证实，MSCs体内移植可以有效改善脑缺血、创伤性脑损伤或帕金森病脑损伤等大鼠模型的神经功能(Chen，2000；Chen，2001；LiY,2001；MahmoodA，2001；许予明，2004)。MSCs用于移植具有以下的优点：①具有贴壁生长的特性易于在体外分离和扩增；具有强大的增殖能力，足以满足移植的需要；在适宜的条件下MSCs可在体外传25代。1ml骨髓吸取物经传代后可产生几十亿个MSC(Colter，2000)。②可在体内外表达多种治疗性的外源目的基因(Chen，2000；HoCY，2005)，被认为是一种理想的基因治疗中的靶细胞。③可以进行自体移植，避免了免疫排斥问题。④除局部定位移植外，还可进行系统移植如经静脉输注(Li,2001；Yukinori，2002；Chen2001)，此移植方式便于今后应用于临床。 然而，取材于骨髓的MSCs同时也存在着应用上的局限性：首先，骨髓MSCs的取材对供者仍可造成一定的损伤；其次，个体骨髓容易受到病原的侵袭尤其是疱疹病毒的感染；再次，随年龄增长骨髓细胞数量及其增殖和分化潜能下降(DIppolito，1999；Rao，2001)等。因此，寻找新的MSCs来源很有必要。与人骨髓和外周血相比，源于脐血的间充质干细胞(umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，UCB-MSCs)所具备的来源丰富、易获性、无创性、较少受病原体侵袭、可用于冻存等优点，使其在近年来逐渐受到研究者的重视。而且，脐血免疫原性相对较弱，其内淋巴细胞相对不成熟(TaylorS，1985；LuL，1996)，还能用于HLA(humanleucocytesantigen，人类白细胞抗原)配型不符者之间输注(Maitra，2004)。如果源于脐血的MSCs能在体外培养并建系，有望成为临床上治疗中枢神经系统损伤和退行性病变的可行性方法。尤其针对于新生儿HIBD，由于骨髓采集存在一定困难，自体脐血取材的便利性、无创性、实用性等优势显而易见。 然而迄今为止，对UCB-MSCs的研究目前仍处于初级探索阶段，远不如骨髓MSCs被广泛研究应用，其主要面临的问题如下：①UCB-MSCs体外培养困难，从脐血中收获MSCs的成功率远低于骨髓，文献报道均未超过30％(Erices，2000；周敦华，2003；Bieback，2004)，足月儿产率更低为12.5％(Bieback，2004)，而骨髓MSCs一般在60％以上。所以体外培养所碰到的数量少、成功率低是UCB-MSCs用于研究首先面临的一个重要问题。那么是什么因素影响了UCB-MSCs体外培养的成功率?其原因尚不清楚。②体外诱导UCB-MSCs定向分化为神经元的方法尚不成熟。与之相比，骨髓MSCs的定向诱导则比较成熟。虽然UCB-MSCs和骨髓MSCs两者在形态学、生物学性状和多向分化潜能等方面有很多相似之处。但在向神经细胞定向分化的过程中，不同的诱导方法可能会出现不同的效果，如Jeong(2004)借鉴经典的体外诱导骨髓MSCs分化为神经细胞的两种方法分别是抗氧化剂的诱导方法和促进胞浆内cAMP升高的诱导方法用于UCB-MSCs，发现前种方法诱导后可快速获得神经元样细胞；而后者几乎不产生任何诱导效果。因此UCB-MSCs和骨髓MSCs的定向诱导分化方法是不可同日而语的，有必要进一步探讨。③提高MSCs体内移植后向神经元方向的分化率为一难题。文献报道移植后的骨髓MSCs仅有0.5％～1％分化为神经元(LiY2001；LiY2002；ChenJ，2001)，其数量远远达不到移植治疗的需要。UCB-MSCs在此领域的研究尚为空白。针对于新生儿科领域中的缺氧缺血性脑损伤的选择性神经元坏死的主要病理特点，设想如能提高MSCs在移植之后定植于脑组织局部经脑内环境的诱导后细胞中神经元细胞的比例将更有利于发挥其真正意义上的替代性的治疗作用。 综上所述，本研究三部分实验目的如下：第一部分从胎龄、脐血采集量、脐血单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)含量等数个方面来探讨影响UCB-MSCs成功培养的相关因素，并在此基础上探讨其生物学特性，以期提高UCB-MSCs的培养成功率；第二部分寻找一种高效、细胞损伤小、适于UCB-MSCs体外分化为神经细胞的诱导方法。第三部分构建含有neurogenin1(神经元素1，ngn1)真核表达质粒，研究ngn1在模拟的体内环境中对UCB-MSCs定向分化为神经元的作用，以期提高MSCs体内移植后神经元的分化率。 结论1.可以从脐血中分离获得MSCs，具有与骨髓MSCs相似的形态学特征、增殖特征和免疫表型。脐血MNCs接种数量在1.25×108/L以上，可以提高培养的成功率。低胎龄者UCB-MSCs集落形成能力高于高胎龄者。相同容量内脐血MNCs与胎龄呈负相关。2.黄芩苷和bFGF、EGF联合可以体外诱导UCB-MSCs分化为神经细胞，该诱导体系细胞存活良好，分化方向主要为较成熟的神经元。3.成功构建含有ngn1基因的真核表达载体；证实ngn1可提高UCB-MSCs定向分化为神经元样细胞的比率。