蓝桉叶化感活性物质缓释微球的制备及其长效抑藻效应研究

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富营养化水体蓝藻水华(cyanobacterial blooms)的爆发对水生态环境以及人类健康构成了严重威胁。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)作为世界上常见的有害蓝藻物种之一,其过度繁殖会引发水环境浊度增加、水体溶解氧降低和水生生物死亡等一系列环境问题。开发有效的新型抑藻剂是当下蓝藻水华防治的研究热点。采用包埋化感物质的缓释微球应用于长效控藻是近几年的研究热点,为了提高该技术的应用前景,寻找高效抑藻的环境友好型物质作为包埋对象,并探究其抑藻机理的研究十分重要。同时也为揭示水生植物低剂量分泌次生代谢产物抑制浮游藻类生长的机理提供理论基础。由于蓝桉叶水提液对铜绿微囊藻细胞的生长具有一定的化感抑制作用,本文以蓝桉叶提取物(Eucalyptus globulus extracts of leaves,ELE)为核心包埋物质,结合微球化技术制备了蓝桉叶化感物质缓释微球。同时,本文采用响应面法优化了蓝桉叶化感物质缓释微球的制备工艺,使用优化后的微球对铜绿微囊藻进行了长期抑藻实验,并通过对铜绿微囊藻细胞超微结构的表征和对细胞内活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、细胞膜完整性、细胞酯酶活性、胞外微囊藻毒素(MCs)的测定,研究了蓝桉叶化感物质缓释微球对铜绿微囊藻的抑制效果和抑制机理。主要研究结果如下:(1)本文分别采用振荡浸提法、加热浸提法和超声浸提法提取蓝桉叶提取物,不同提取方法下的蓝桉叶提取物对铜绿微囊藻(M.aeruginosa FACHB 905)显示出不同的抑制程度,其中振荡10天的蓝桉叶提取物抑藻效果最好,抑藻率可达到44.32%;用不同树龄(3、5、8和20年)的蓝桉叶提取物进行抑藻实验,结果显示5年树龄的蓝桉叶提取物抑藻效果最好,抑藻率可达到73.94%;不同浓度的蓝桉叶提取物抑藻实验结果显示,0.5 g/L、1 g/L、2 g/L和3 g/L的蓝桉叶提取物在实验第16天的抑藻率分别为19.52%、46.18%、76.41%和85.16%,表明蓝桉叶提取物与抑藻率之间有明显的剂量效应关系;采用LC-MS对蓝桉叶提取物中有机化合物的成分进行鉴定分析,结果显示提取物中含有儿茶素、没食子酸、鞣花酸等多种常见的酚酸类化感物质。(2)本文分别讨论了蓝桉叶化感物质缓释微球制备过程中蓝桉叶提取物(芯材溶液)浓度、海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、氯化钙浓度以及芯壁溶液体积比例(蓝桉叶提取物溶液体积∶海藻酸钠溶液体积)对微球负载率与包埋率的影响,得到蓝桉化感物质缓释微球的最佳芯材浓度为18 g/L,最佳芯壁溶液体积比例为2∶3;并设计响应面优化实验以进一步提高缓释微球包埋率,得到最佳制备参数为:海藻酸钠浓度为2.13%(w/v),壳聚糖浓度为1.02%(w/v),氯化钙浓度为0.78%(w/v);且三个因素对缓释微球包埋率的影响程度顺序为:海藻酸钠浓度>氯化钙浓度>壳聚糖浓度。最优制备条件下,缓释微球包埋率可达到61.45%;蓝桉叶化感物质缓释微球的释放性能测试结果显示,优化后的缓释微球有良好稳定的缓释性能。(3)在不同投加量(2.5 g/L、5 g/L、10 g/L)的蓝桉叶化感物质缓释微球,不同浓度(0.578 g/L、3 g/L)的蓝桉叶提取物和10 g/L的空白微球对铜绿微囊藻(M.aeruginosa FACHB 905)进行的长期抑藻实验中,10 g/L蓝桉叶化感物质缓释微球组的抑藻效果最好,抑藻率最高可达92.99%;对铜绿微囊藻细胞的超微结构进行表征,结果显示蓝桉叶化感物质缓释微球会严重破坏细胞内部结构使细胞瓦解死亡,且微球材料本身对藻细胞有吸附作用;对藻细胞生理指标的测定结果显示,10 g/L蓝桉化感物质缓释微球组在实验第15、30和45天的藻细胞内活性氧(ROS)水平分别是对照组的9.25、3.69、4.94倍,一氧化氮(NO)水平分别是对照组的2.16、2.58和2.41倍,细胞膜受损的细胞比例分别为21.4%、49.71%、54.26%,表明蓝桉叶化感物质缓释微球会对铜绿微囊藻产生氧化胁迫,使细胞ROS水平和NO水平明显上升,还会严重破坏藻细胞膜的完整性,降低细胞的酯酶活性;同时,蓝桉叶化感物质缓释微球还会使藻细胞胞外微囊藻毒素含量降低,说明微球对微囊藻毒素有一定的去除效果。综上所述,本文模拟水生植物低剂量持续释放化感物质的抑藻模式,制备了对铜绿微囊藻(M.aeruginosa FACHB 905)的生长有长效抑制作用的蓝桉叶化感物质缓释微球,实现了植物废弃物资源的有效再利用,探究了蓝桉叶化感物质缓释微球的抑藻机制,为微球化技术在植物化感物质控藻法中的引入提供参考。
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