l-薄荷醇作为一种香料在医药、食品、饮料、日用化工、化妆品中被广泛应用,近年来,薄荷醇的需求量不断增长,天然提取的薄荷醇的产量已无法满足日益增长的工业需要,因而开发新的合成方法生产l-薄荷醇的经济意义日渐增大。在本实验中,我们设计了一条以香叶醇为底物生产l-异胡薄荷醇的生物合成途径。这个酶级联反应共分为三个步骤,酶Ⅰ GeDH(adhp)将底物香叶醇氧化为香叶醛,香叶醛再在酶Ⅱ OYE2p(ER3)的作用下还原为香茅醛,最后通过环化酶的作用生成l-异胡薄荷醇。但是我们发现第一步反应的氧化酶adhp的活性很高,约是第二步反应还原酶活性的10倍左右,使得第一步反应生成的香叶醛不能及时完全转化为香茅醛,造成香叶醛及NADH的大量积累。而NADH的大量积累又会被酶Ⅰ(adhp)所利用,会将中间体香叶醛和香茅醛转化为香叶醇、香茅醇等副产物,降低了多酶级联反应效率,影响目标产物的有效合成。这里,我们将针对adhp与ER3的酶活不匹配问题,利用光敏蛋白AsLOV2插入的方法,通过蛋白之间的结构扰动实现对adhp蛋白活性的精确可逆光学调控,实现酶活匹配,尽量减少辅酶外溢从而减少副反应的发生,使级联反应体系能够更加顺利地朝着目标产物合成的途径进行。研究内容包括以下几个方面:1、筛选光敏蛋白AsLOV2的插入位点。首先是通过晶体结构分析和序列比对确定光敏蛋白AsLOV2域插入的位点,在不干扰蛋白结构的前提下,围绕adhp蛋白的催化活性中心进行筛选。最终确定表面暴露的loop环上的10个非保守位点,将AsLOV2域成功插入到这10个位点中构建具有光开关的融合体分别命名为alov1-10;在不影响原酶酶活的基础上我们又从这10个融合蛋白里筛选出alov9作为后续实验的研究。2、在时间和空间上实现对融合蛋白alov9的精确可逆调控。首先探索了光学抑制作用,其次对光照时间、光照强度、光照距离、辅因子FMN浓度等因素进行研究,分析这些因素对光学抑制作用产生的影响;最后对alov9蛋白的可逆调控进行了探索。3、确定胞外催化反应的光控条件。首先通过筛选最适温度和pH值确定最佳反应条件;其次对胞外反应体系中酶Ⅰ adhp和酶Ⅱ ER3的酶活投放比例进行探索,探测不同比例条件下的反应过程曲线,通过分析反应过程曲线中各个物质的生成来选择合适的光照时间点对胞外催化反应进行光学调控。4、胞外光学催化实验。在胞外反应进行过程中,对反应体系加以470nm蓝光光照。我们假设通过蓝光激发,alov9蛋白的活性得到抑制与第二步反应的还原酶Ⅱ ER3实现活性匹配,与空白对照组相比,最终副产物产量最大程度减少54%,而产物香茅醛的产量能够增加31%。综上所述,我们利用光敏蛋白AsLOV2成功实现了对adhp氧化酶的酶活调节,解决了多酶级联反应过程中酶活不匹配的问题,通过光学调节,减少副产物的生成,使反应流更多的流向产物生成的途径,最终提高了中间产物R-香茅醛的产量。将光敏蛋白插入到目标蛋白活性位点附近实现对原酶的控制,这是对光敏蛋白的创新性使用,为其他的代谢调控研究提供新的思路和方法。