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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,缩写为H.pylori或HP)是引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃MALT淋巴瘤的主要病原体,近些年,其与缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜等胃外疾病的关系也日益受到重视。HP在全世界范围内有50%以上的人口感染,根据2017年最新资料,我国HP感染率约为41.7%。HP感染多发生在幼年,如不经根除治疗,机体固有免疫及适应性免疫应答均无法将其清除。2015年在日本京都达成的“幽门螺杆菌胃炎京都全球共识”(简称京都共识)进一步强调了HP感染导致的慢性胃炎是一种感染性疾病,无症状感染者同样建议根除。近些年来,由于抗生素的不合理使用,尤其是在发展中国家,细菌耐药的现象愈发严重,而HP的根除方案往往是检出HP感染后,给予经验治疗方案。随着耐药率的上升,HP根除成功率正逐年下降。由于HP在胃内长期定植,HP发生的基因突变和重组累积导致胃内HP高度的遗传异质性。近年来,异质性耐药的现象得到越来越多的关注,其首次发现是在金黄色葡萄球菌中,而后在结核分枝杆菌、鲍曼不动杆菌及肠球菌中引起重视。异质性耐药对传统的基于分离培养药敏试验是一个极大的挑战,因为临床上对胃黏膜样本进行分离培养时仅挑取有限的HP单菌落数量,有可能造成对耐药菌落的漏选,从而导致根除治疗失败。对于HP异质性耐药的研究,已有部分报道,但仅限于对异质性耐药的检测及毒力蛋白分型、随机扩增多态性分析等,并没有对异质性耐药的具体特征和成因进行进一步分析。第一部分:对幽门螺杆菌克拉霉素、左氧氟沙星的异质性耐药分析及两种检测方法的比较本研究中,在胃镜采样中运用细胞刷分别刷取49例13C尿素呼气试验阳性患者的胃窦部和胃体部黏液组织1～2ml和粪便样本,对胃黏液样本进行倍比稀释后分离培养,每一个样本选取16个HP单菌落,利用镜检、生化实验和质谱方法鉴定为HP后扩大培养,进行克拉霉素和左氧氟沙星Etest法药敏试验,分析患者胃内的异质性耐药情况;同时应用数字微滴PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法对胃黏液样本和粪便样本同时进行HP 16S rRNA和23S rRNA野生型和突变型的检测,以期建立一种基于粪便的对HP感染及部分抗生素耐药性的无创检测方法。研究结果表明:用分离培养、胃黏液ddPCR和粪便ddPCR的方法,49例患者中分别得到43例、46例、43例HP阳性。对所得HP克隆进行克拉霉素Etest药敏试验后发现,23个样本中所有HP克隆为克拉霉素敏感克隆、11个样本为异质性耐药、9个样本中所有HP克隆为克拉霉素耐药克隆。对来自15个胃窦黏液样本的160个HP克隆进行左氧氟沙星Etest药敏试验发现,其中有8个样本中所有HP克隆为左氧氟沙星敏感克隆、3个异质性耐药样本和4个样本中所有HP克隆为左氧氟沙星耐药克隆。利用ddPCR的方法对胃黏液和粪便样本中克拉霉素耐药基因HP 23S rRNA基因型进行检测发现,胃黏液样本中22例野生型、13例为野生型与突变型的混合、10例突变型,胃窦样本与胃体样本一致;粪便样本中17例野生型、17例为野生型与突变型的混合、11例突变型;比较胃黏液样本与粪便样本发现其中33例(75%)表现一致:15例野生型、10例混合型、8例突变型。比较克拉霉素Etest试验与HP 23S rRNA ddPCR检测后:发现43例中有37例(86%)结果一致:19例敏感/野生型、9例异质性耐药/混合型、9例耐药/突变型。本研究首次利用无创细胞刷刷取胃黏液进行HP分离培养,并首次对比了数字PCR(ddPCR)方法和传统的分离培养方法对于HP感染和克拉霉素耐药检测(尤其是异质性耐药检测)的效果,发现患者感染的HP对克拉霉素和左氧氟沙星存在明显的异质性耐药现象,且ddPCR方法检测克拉霉素耐药灵敏度更高;发现于粪便样本的ddPCR方法对HP感染和克拉霉素耐药的检出与基于胃黏液ddPCR和基于分离培养的Etest方法同样有效,有望成为一种无创的检测克拉霉素耐药的新方法。第二部分:幽门螺杆菌对克拉霉素异质性耐药样本相关菌株的MLST分析本研究利用多位点序列分析技术(multilocus sequence typing,MLST)结合HP克隆对克拉霉素耐药情况对来自6个克拉霉素异质性耐药样本的81个HP克隆进行遗传进化分析。研究结果显示:6个样本的最低抑菌浓度值差异较大,最大值与最小值的差别在2～3个数量级之间。MLST分析中81个HP克隆总共得到17个ST型别,均为新的ST型,每个样本的9～16个克隆可分为1～6个ST型,结合vacA基因差异,进一步分为2～8个基因型。在遗传进化树中,每个样本的HP克隆分别聚为一簇,来自同一样本的HP克隆遗传距离远小于样本间HP克隆群的遗传距离。异质性耐药样本中近源HP克隆可表现为对克拉霉素一致的敏感性,也可表现出对克拉霉素敏感性的较大差异;反映耐药压力筛选和细菌耐药负担在不同患者胃内HP的菌株演化中的作用不同。