论文部分内容阅读
目的:
结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其侵袭和转移极大地影响了患者病情的进展、治疗和预后。结直肠癌的侵袭转移是一个涉及多个阶段并由多种基因参与的复杂生物过程，其中癌细胞自身运动能力的增强是其显著特点之一，研究表明癌细胞会形成侵袭性伪足(Invadopodia)，进而发生侵袭和转移。这种伪足的形成有赖于细胞膜下的肌动蛋白的装配(Actin assembly)，Arp2/3复合物的催化作用是其中的关键环节，后者可以受WASP(Wiskott-Ardrich综合症蛋白)家族激活而活化。
课题组前期通过系列研究证实LASP1(LIM and SH3protein1)是结直肠癌转移相关蛋白，有望成为晚期结直肠患者治疗策略的作用靶点。为进一步揭示在结直肠癌转移过程中LASP1发挥的调控作用，本研究以酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system，YTHS)筛选LASP1相互作用蛋白为研究切入点，旨在揭示LASP1通过蛋白质相互作用参与结直肠癌转移过程的新机制，为肿瘤治疗及药物研发提供潜在的生物学靶标。
方法:
（一）LASP1相互作用蛋白N-WASP的筛选及其鉴定
1采用酵母双杂交系统筛选LASP1相互作用蛋白的候选蛋白;
2对前期筛选出的候选蛋白WASP及其同族蛋白N-WASP在结直肠癌细胞株中的表达进行蛋白水平及mRNA水平的检测;
3探究LASP1与N-WASP在结直肠癌细胞中的表达调控关系;
4免疫荧光方法研究LASP1和N-WASP在细胞中的共定位现象;
5免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)方法正反向验证LASP1和N-WASP在细胞内的相互作用。
（二）N-WASP在结直肠癌中的生物学功能
1以Migration Assay和Invasion Assay研究N-WASP对结直肠癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响;
2以罗丹明标记的鬼笔环肽作为染料对肌动蛋白骨架进行染色，研究N-WASP对结直肠癌细胞骨架分布的影响。
（三）N-WASP与LASPI相互作用结构域的验证
1以分子克隆的方法构建LASP1结构域缺失的突变表达载体;
2免疫共沉淀方法验证N-WASP与LASPI的相互作用结构域;
3利用缺失突变体，结合细胞骨架荧光染色的方法研究LASP1与N-WASP的相互作用对细胞骨架的影响。
结果:
（一）LASP1相互作用蛋白N-WASP的筛选及其鉴定
1酵母双杂交实验筛选出10种候选LASP1相互作用蛋白，从中筛选出与细胞骨架相关的蛋白WASP进行下一步研究;
2对1株正常肠上皮细胞及8株结直肠癌细胞进行Western Blot及Q-PCR检测，证实结直肠癌细胞中的WASP呈现低表达，而其同族蛋白N-WASP在结直肠癌中高表达，是能与LASP1发生相互作用的蛋白分子;
3利用激光共聚焦显微镜观察结直肠癌细胞系SW620、RKO中N-WASP和LASP1的共定位情况，结果显示LASP1主要表达于细胞浆，N-WASP主要表达于细胞浆，两种蛋白可以共定位于细胞浆中;
4内源性的免疫共沉淀结果显示，在抗LASP1抗体沉淀LASP1蛋白的同时，N-WASP也一同被沉淀，而抗N-WASP抗体在沉淀N-WASP蛋白的同时，LASP1蛋白也一同被沉淀，说明LASP1与N-WASP在细胞内存在相互作用。
（二）N-WASP在结直肠癌中的生物学功能研究
1利用Transwell小室进行迁移和侵袭实验，结果表明敲低N-WASP表达可以对结直肠癌细胞的迁移和侵袭起到抑制作用，而过表达N-WASP后则起到相反作用;
2利用划痕实验检测N-WASP对结直肠癌细胞运动能力的影响，得出与迁移实验相同的结果。
3利用荧光染色的方法对细胞骨架进行染色，结果表明N-WASP的高表达可以促进细胞骨架的组装，促进伪足形成，进而增强结直肠癌细胞的侵袭转移能力。
（三）N-WASP与LASP1相互作用结构域的验证
1成功构建并验证了LASPI缺失突变表达载体;
2免疫共沉淀结果显示，以抗flag标签抗体沉淀pcDNA3-flag-LASP1-SH3蛋白的同时，N-WASP也被一同沉淀，说明在细胞内，N-WASP可与LASP1的SH3结构域发生相互作用。
3免疫荧光染色后观察肌动蛋白细胞骨架，结果显示，与对照组相比，过表达LASP1或外源性表达LASP1的SH3结构域突变体，促进了细胞骨架组装，使细胞伪足产生增多。
结论:
1N-WASP的过表达可促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭，N-WASP的敲低可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。
2N-WASP是LASP1相互作用蛋白之一，两者共定位在胞浆，LASP1的SH3结构域可与N-WASP发生结合，通过相互作用促进细胞骨架组装和伪足形成，从而促进结直肠癌的侵袭和转移。
创新性
1首次提出N-WASP是LASP1相互作用蛋白之一，并验证了二者的相互作用结构域。
2N-WASP能与LASP1发生相互作用，促进细胞骨架的组装和伪足形成，进而促进结直肠癌细胞的侵袭和转移。
结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其侵袭和转移极大地影响了患者病情的进展、治疗和预后。结直肠癌的侵袭转移是一个涉及多个阶段并由多种基因参与的复杂生物过程，其中癌细胞自身运动能力的增强是其显著特点之一，研究表明癌细胞会形成侵袭性伪足(Invadopodia)，进而发生侵袭和转移。这种伪足的形成有赖于细胞膜下的肌动蛋白的装配(Actin assembly)，Arp2/3复合物的催化作用是其中的关键环节，后者可以受WASP(Wiskott-Ardrich综合症蛋白)家族激活而活化。
课题组前期通过系列研究证实LASP1(LIM and SH3protein1)是结直肠癌转移相关蛋白，有望成为晚期结直肠患者治疗策略的作用靶点。为进一步揭示在结直肠癌转移过程中LASP1发挥的调控作用，本研究以酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system，YTHS)筛选LASP1相互作用蛋白为研究切入点，旨在揭示LASP1通过蛋白质相互作用参与结直肠癌转移过程的新机制，为肿瘤治疗及药物研发提供潜在的生物学靶标。
方法:
（一）LASP1相互作用蛋白N-WASP的筛选及其鉴定
1采用酵母双杂交系统筛选LASP1相互作用蛋白的候选蛋白;
2对前期筛选出的候选蛋白WASP及其同族蛋白N-WASP在结直肠癌细胞株中的表达进行蛋白水平及mRNA水平的检测;
3探究LASP1与N-WASP在结直肠癌细胞中的表达调控关系;
4免疫荧光方法研究LASP1和N-WASP在细胞中的共定位现象;
5免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)方法正反向验证LASP1和N-WASP在细胞内的相互作用。
（二）N-WASP在结直肠癌中的生物学功能
1以Migration Assay和Invasion Assay研究N-WASP对结直肠癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响;
2以罗丹明标记的鬼笔环肽作为染料对肌动蛋白骨架进行染色，研究N-WASP对结直肠癌细胞骨架分布的影响。
（三）N-WASP与LASPI相互作用结构域的验证
1以分子克隆的方法构建LASP1结构域缺失的突变表达载体;
2免疫共沉淀方法验证N-WASP与LASPI的相互作用结构域;
3利用缺失突变体，结合细胞骨架荧光染色的方法研究LASP1与N-WASP的相互作用对细胞骨架的影响。
结果:
（一）LASP1相互作用蛋白N-WASP的筛选及其鉴定
1酵母双杂交实验筛选出10种候选LASP1相互作用蛋白，从中筛选出与细胞骨架相关的蛋白WASP进行下一步研究;
2对1株正常肠上皮细胞及8株结直肠癌细胞进行Western Blot及Q-PCR检测，证实结直肠癌细胞中的WASP呈现低表达，而其同族蛋白N-WASP在结直肠癌中高表达，是能与LASP1发生相互作用的蛋白分子;
3利用激光共聚焦显微镜观察结直肠癌细胞系SW620、RKO中N-WASP和LASP1的共定位情况，结果显示LASP1主要表达于细胞浆，N-WASP主要表达于细胞浆，两种蛋白可以共定位于细胞浆中;
4内源性的免疫共沉淀结果显示，在抗LASP1抗体沉淀LASP1蛋白的同时，N-WASP也一同被沉淀，而抗N-WASP抗体在沉淀N-WASP蛋白的同时，LASP1蛋白也一同被沉淀，说明LASP1与N-WASP在细胞内存在相互作用。
（二）N-WASP在结直肠癌中的生物学功能研究
1利用Transwell小室进行迁移和侵袭实验，结果表明敲低N-WASP表达可以对结直肠癌细胞的迁移和侵袭起到抑制作用，而过表达N-WASP后则起到相反作用;
2利用划痕实验检测N-WASP对结直肠癌细胞运动能力的影响，得出与迁移实验相同的结果。
3利用荧光染色的方法对细胞骨架进行染色，结果表明N-WASP的高表达可以促进细胞骨架的组装，促进伪足形成，进而增强结直肠癌细胞的侵袭转移能力。
（三）N-WASP与LASP1相互作用结构域的验证
1成功构建并验证了LASPI缺失突变表达载体;
2免疫共沉淀结果显示，以抗flag标签抗体沉淀pcDNA3-flag-LASP1-SH3蛋白的同时，N-WASP也被一同沉淀，说明在细胞内，N-WASP可与LASP1的SH3结构域发生相互作用。
3免疫荧光染色后观察肌动蛋白细胞骨架，结果显示，与对照组相比，过表达LASP1或外源性表达LASP1的SH3结构域突变体，促进了细胞骨架组装，使细胞伪足产生增多。
结论:
1N-WASP的过表达可促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭，N-WASP的敲低可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。
2N-WASP是LASP1相互作用蛋白之一，两者共定位在胞浆，LASP1的SH3结构域可与N-WASP发生结合，通过相互作用促进细胞骨架组装和伪足形成，从而促进结直肠癌的侵袭和转移。
创新性
1首次提出N-WASP是LASP1相互作用蛋白之一，并验证了二者的相互作用结构域。
2N-WASP能与LASP1发生相互作用，促进细胞骨架的组装和伪足形成，进而促进结直肠癌细胞的侵袭和转移。