鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤,肿瘤进展极易侵犯颅底等重要结构,并较早发生颈部淋巴结转移和远处转移。鼻咽癌表现为种族和地区分布的特点,是我国十大高发恶性肿瘤之一,其发病率为20/100,000,已引发严重健康问题。鼻咽癌是由Epstein-Barr病毒(EBV)的潜伏感染、环境因素和宿主的基因遗传因素共同参与的多步骤交互作用而逐步形成的复杂性疾病。几乎所有的鼻咽癌细胞都含有EBV基因组,并表达EBNA1,EBER1,EBER2,和LMP1,LMP2A,LMP2B,这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤标志物,其中LMP2A(latent membrane protein2A,LMP2A)在鼻咽上皮细胞的转化和癌变过程中的作用倍受关注,是目前公认的病毒癌基因之一。它参与了鼻咽癌发生和发展,以LMP2A为靶标,设计并制备各种具有中和作用或靶向功能的抗体将会为鼻咽癌的诊断和靶向治疗提供新的方法。本研究拟以基因工程技术设计并表达LMP2A的表位融合蛋白LMP25,分析其免疫原性,利用纯化的LMP25蛋白和鼻咽癌细胞(SUNE、CNE)通过全人源噬菌体抗体展示技术筛选人源抗LMP2A胞外区抗体Fab(命名为Fab29),对筛选获得的Fab29进行表达、纯化以及功能鉴定。方法1.表位融合蛋白的设计及表达载体的构建:根据Genebank中的LMP2A基因序列和文献报道,选择LMP2A的表位基因序列。LMP2A第二胞外区基因为:TGTCTGACGTGGCGTATTGAAGACCCGCCGTTTAACAGCCTGCTGTTTGCCCTGC TGGCAGCAGCCGGT,LMP2A第五胞外区基因为:GGCGGCAGCATTCTGCAAACCA ACTTCAAAAGCCTGAGCAGCACCGAATTCATCCCGAACCTGTTT。优化表位融合蛋白的基因序列,设计LMP2A第二、五胞外区重复串联基因,分别在5’端和3’端设置酶切位点Bam HI和Xho I,克隆于p ET28a表达载体中,构建LMP2A的表位融合蛋白的表达载体。2.表位融合蛋白LMP2A的表达和纯化:重组表达载体经测序确认正确后转化至大肠杆菌BL21,选择单克隆菌落,扩大培养并诱导表达。表达产物经8M尿素变性后Ni-NTA层析柱纯化,复性后Coomassie brilliant blue染色后检测蛋白纯度。3.重组表位融合蛋白的鉴定:Western blot鉴定纯化的重组LMP2A表位融合蛋白。用纯化LMP2A重组表位融合蛋白作为抗原免疫小鼠。ELISA检测小鼠抗血清效价后并用免疫组织化学分析该小鼠多抗的特异性和抗原的免疫源性。4.抗体的筛选:利用鼻咽癌细胞(SUNE,CNE)与纯化抗原LMP25(已证明有免疫原性的LMP2A融合蛋白)采用差减筛选和固相筛选相结合的方法进行筛选人源噬菌体抗体库(Fab抗体库)。第1、3、5轮通过细胞的差减筛选,第2、4、6轮通过固相筛选。其中,细胞差减筛选以鼻咽癌细胞CNE为阴性细胞,鼻咽癌细胞SUNE为阳性细胞;固相筛选以包被LMP2A融合蛋白为筛选抗原。筛选6轮后经噬菌体酶联免疫吸附反应(phage enzyme linked immunosorbent assay,phage ELISA)进行阳性克隆鉴定。5.Fab29抗体的原核表达的鉴定和纯化:Fab29噬菌体感染大肠杆菌Top 10F’,培养细菌至对数生长期,IPTG诱导表达;表达蛋白产物使用Protein L亲和层析柱纯化。6.纯化Fab29的生物特性分析:纯化产物经ELISA、流式细胞技术、免疫共沉淀、免疫荧光、亲和力测试和免疫组化技术进行该抗体的特异性、结合率和亲和力的测试。结果1.经核酸序列分析证实,LMP2A第二、五胞外区重复串联基因与设计的目的蛋白序列一致,并克隆于p ET28a表达载体中诱导表达。2.诱导结果经SDS-PAGE检测显示:质粒在大肠杆菌中能顺利表达,而且产量较高。通过蛋白变性His亲和层析纯化,复性后再经SDS-PAGE鉴定,纯化后的重组蛋白纯度较高。3.纯化后蛋白经Western blot检测结果显示,其能够被大鼠抗LMP2A抗体所捕获。用此蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体,经间接ELISA分析,检测结果与抗体浓度相关,当抗体浓度稀释至1:256000时,其OD450值小于0.2,其效价达1:256000。免疫组织化学分析结果显示,该抗体具有商业化大鼠抗LMP2A抗体相同的特性,能够识别鼻咽癌患者肿瘤切片中的LMP2A蛋白。4.基因测序显示筛选获得29号Fab抗体基因序列轻链为κ链,重链为λ链。5.Fab29在原核表达系统内能够表达并正确组装;使用Protein L亲和层析柱纯化获得了纯度较高的可溶性抗体Fab29。6.ELISA结果示在Fab29浓度为50μg/ml的时候0D450的值能达到1.613;流式细胞技术提示Fab29与SUNE细胞的结合率高达96.89%;免疫共沉淀提示Fab29所捕获的蛋白就是LMP2A蛋白;免疫荧光结果示Fab29定位于细胞的表面;亲和力检测结果显示Fab29与融合蛋白的亲和力达到1.79×10-9;免疫组化的结果显示Fab29能够与LMP2A表达阳性的鼻咽癌患者的肿瘤细胞结合。结论1.本实验证明了通过基因工程技术设计的LMP2A胞外区LMP25重复串联载体能够在原核表达系统中表达的可能性。纯化出可溶性的LMP25蛋白能够免疫小鼠获得高亲和力的多克隆抗体,免疫组化的结果说明LMP25具有较高的稳定性和免疫源性,能够代表LMP2A蛋白用于人源抗LMP2A抗体的筛选。2.通过全人源抗体库,采用差减筛选法和固相筛选法可以获得高亲和力的抗LMP2A胞外区抗体Fab29。3.Fab29可以在原核表达系统中表达并组装具有生物活性的可溶性LMP2A胞外区特异性抗体。ELISA、细胞流式、免疫共沉淀、免疫荧光、亲和力测试以及免疫组化都说明了Fab29具有与天然构象的LMP2A特性结合的能力且亲和力较高。总之,本研究制备了LMP2A的重组融合蛋白(LMP25)且其能很好的代表LMP2A蛋白的免疫源性并利用LMP25和鼻咽癌细胞筛选出全人源抗LMP2A的Fab29单克隆抗体。通过一系列的生物学鉴定试验证明了该单克隆抗体能够特异性与天然构象的LMP2A蛋白结合。该抗体可用于对LMP2A蛋白的生物学研究。在肿瘤研究中意义更大,以该项技术制得的抗体可以作为载体分子进行肿瘤影像学诊断及免疫治疗。