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研究背景流行病学研究显示,糖尿病餐后高血糖的发生率高达50%,糖尿病前期约70%为单纯性葡萄糖耐量。研究发现餐后高血糖与多种糖尿病慢性并发症密切相关,而控制餐后血糖升高是防治糖尿病的重要策略之一。近年来,作为营养物质吸收的主要器官的小肠在餐后高血糖发生和糖尿病发病过程中的作用逐渐受到重视。研究认为糖尿病小肠葡萄糖吸收功能病理性增强,与餐后血糖升高密切相关。小肠葡萄糖吸收主要由SGLT-1(钠-葡萄糖共转运体1)和GLUT-2(葡萄糖转运体2)介导,其中,GLUT-2介导的葡萄糖转运是餐后小肠吸收葡萄糖的主要方式。进食后,GLUT-2由小肠黏膜上皮细胞胞浆转位至刷状缘,以异化扩散形式将葡萄糖由肠腔转运到血液中。而当罹患糖尿病时,GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞刷状缘持续性定位,这可能是糖尿病小肠葡萄糖吸收功能增强及餐后高血糖的原因。因此,纠正糖尿病小肠葡萄糖吸收功能病理性增强成为治疗糖尿病餐后高血糖的重要策略。小檗碱是中药黄连的有效成分,是异喹啉类生物碱。因在治疗腹泻患者时偶然发现低血糖反应而引起糖尿病相关研究者的关注。小檗碱治疗糖尿病的作用机制包括改善糖尿病心血管功能、改善糖脂代谢、改善糖尿病和降低心血管疾病的危险因素等诸多方面。但因小檗碱的生物利用度低,其多项药理学作用机制及临床应用存在争议。尽管有研究表明小檗碱在肠道浓度高,可在肠道局部发挥代谢调节作用,包括抑制二糖酶的功能;促进GLP-1(胰高血糖素样肽1)释放;调节肠道菌群结构等。但小檗碱能否缓解糖尿病小肠葡萄糖吸收能力增强和餐后高血糖的直接证据依然缺乏。针对上述问题,我们课题组在以往研究的基础上,对小檗碱降低糖尿病餐后高血糖的肠道机制做了深入研究。实验目的探讨小檗碱改善糖尿病血糖是否与其在小肠局部影响葡萄糖转运有关,并探讨其作用机制。实验方法采用链脲佐菌素(STZ)联合高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠模型。利用随机数表法分组,小檗碱灌胃(200 mg/kg,BW,每日)6周过程中,检测体重、空腹血糖变化情况。通过OGTT、IPGTT(口服葡萄糖耐量、腹腔注射葡萄糖耐量实验)实验检测葡萄糖耐量变化,采用ELISA方法检测血清中GLP-1、GLP-2和胰岛素水平,并检测血清和小肠组织局部IGF-1(胰岛素样生长因子1)、IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)水平。离体条件下,采用小肠组织和大鼠小肠黏膜上皮细胞系(IEC-6细胞)进行荧光葡萄糖转运和葡萄糖摄取实验,观察小檗碱对葡萄糖转运和摄取的影响。提取组织、细胞总蛋白和细胞膜蛋白,通过蛋白免疫印迹技术分析小肠葡萄糖转运蛋白的表达和转位情况。进一步,利用免疫荧光、免疫电镜等技术观察小檗碱对GLUT-2蛋白转位的影响。进而,综合利用药物抑制剂和si RNA技术探讨小檗碱对葡萄糖转运蛋白作用进行分子机制的研究。两组间比较采用Dunnett-t检验,多个处理组两两之间比较采用SNK-q检验。实验结果1.与正常对照组相比,STZ联合高脂饮食诱导的2型糖尿病组小鼠体重显著性增加,空腹血糖水平升高,糖耐量异常。经小檗碱(200 mg/kg/d,BW)灌胃6周治疗后,相较于糖尿病组,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠体重降低、空腹血糖水平下降、葡萄糖耐量得到改善、HOMA-IR降低。2.糖尿病组小鼠小肠葡萄糖转运能力较正常组小鼠增高,糖尿病组小鼠单位进食量所产生的粪便中葡萄糖含量降低。小檗碱(200 mg/kg/d,BW)灌胃6周后,与糖尿病组相比,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠葡萄糖转运能力降低,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠单位进食量所产生的粪便中葡萄糖含量升高。采用正常动物给予单次灌胃小檗碱(200 mg/kg,BW),观察到单次灌胃小檗碱仅对OGTT实验后的血糖变化具有抑制作用,而对IPGTT实验后血糖变化无降低作用,检测OGTT实验后各时间点的血清胰岛素水平,发现小檗碱单次灌胃组血清胰岛素水平显著性降低,提示小檗碱通过其在小肠局部的直接作用抑制小肠葡萄糖吸收,降低餐后血糖水平。3.离体条件下,利用小肠组织和IEC-6细胞研究小檗碱降低小肠葡萄糖转运。与正常组相比,小檗碱组小肠葡萄糖转运和细胞葡萄糖摄取呈现浓度依赖性降低,GLUT-2抑制剂phloretin(0.5 m M)和si RNA敲低GLUT-2表达均能阻断小檗碱降低小肠组织葡萄糖转运和细胞葡萄糖摄取。结果提示,小檗碱降低小肠葡萄糖转运是通过抑制GLUT-2来实现的。4.在糖尿病模型小鼠中,相较于正常对照组,糖尿病小鼠小肠GLUT-2表达增加,采用提取细胞膜进行蛋白免疫印迹分析、免疫荧光实验和免疫电镜实验等方法均观察到:糖尿病小鼠小肠黏膜上皮细胞GLUT-2向刷状缘转位增多。小檗碱(200mg/kg/d,BW)灌胃6周后,相较于糖尿病组,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠GLUT-2表达降低。同时,GLUT-2向刷状缘转位降低。高浓度葡萄糖(50 m M)处理IEC-6细胞模拟肠腔餐后高浓度葡萄糖的条件下,小檗碱处理可浓度依赖性降低IEC-6细胞GLUT-2转位。以上结果提示,小檗碱降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位至刷状缘。5.与糖尿病组相比,小檗碱灌胃6周组小鼠小肠局部IGF-1、IGFBP-3水平降低,同时,小肠组织中IGF-1R和PLC-β2表达分别降低21.5%,23.1%,提示小檗碱灌胃6周可纠正糖尿病小鼠小肠局部IGF水平异常。6.小檗碱下调IEC-6细胞IGF-1R磷酸化,IGF-1R抑制剂AG1024和si RNA敲低IGF-1R表达均可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。同时,小檗碱下调IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位,进一步使用PLC-β2抑制剂U73122可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。使用IGF-1R抑制剂AG1024和si RNA敲低IGF-1R表达均可阻断小檗碱降低细胞PLC-β2胞膜定位。提示小檗碱通过抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取。7.小檗碱上调IEC-6细胞AMPK磷酸化,AMPK抑制剂Compound C(10μM)可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。同时,AMPK抑制剂Compound C可阻断小檗碱降低细胞IGF-1R磷酸化。提示小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R,最终降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取。8.小檗碱未上调IEC-6细胞Akt磷酸化水平,PI3K抑制剂Wortmannin(10μM)未阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2、PLC-β2胞膜定位,提示小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取可能与PI3K-Akt信号通路无关。结论1.小檗碱降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2向刷状缘转位,从而抑制小肠葡萄糖的吸收,最终降低糖尿病小鼠餐后血糖水平2.小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路,进而降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2刷状缘转位