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目的:本课题旨在通过对尼古丁调控肺腺癌A549细胞CFTR基因表达改变以及结合临床吸烟与不吸烟肺癌组织CFTR基因的表达改变,探讨CFTR基因对尼古丁作用肺腺癌A549细胞肿瘤干细胞特性的影响,揭示CFTR基因在肺癌转移、恶化和耐药中的作用机制,为临床肺癌的治疗研究寻求新的靶点。方法:利用MTT法检测,将A549细胞按10~5/孔接种到96孔板中,37℃、5%CO2培养,培养24h后,利用不同浓度的尼古丁刺激A549细胞,培养48h,筛选出最适的尼古丁浓度。通过构建CFTR腺病毒过表达载体以及CFTR干扰腺病毒载体,感染肺腺癌细胞系A549,利用上述筛选出来的尼古丁浓度刺激不同处理组的A549细胞,分别提取不同处理组的细胞全蛋白,并采用Western Blot技术分析在肺腺癌细胞中尼古丁对CFTR基因的表达的情况,从而揭示在肺腺癌细胞中尼古丁对CFTR基因表达的影响。收取胸外科在手术室进行肺叶切除或一侧全肺切除术吸烟肺癌患者与不吸烟肺癌患者的的癌旁正常肺组织标本及癌组织标本各30例,采用qPCR技术分析CFTR在这些肿瘤组织中的表达,以阐明初步确定尼古丁和CFTR基因在肺腺癌发病中的临床相关性。利用CCK8细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验以及克隆形成实验等方法分别检测CFTR的表达对非小细胞肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭等细胞恶性特性的影响。同时通过免疫印迹(Western blotting)分析CFTR基因表达对肿瘤干细胞相关转录因子表达的影响。结果:尼古丁能够抑制CFTR基因的表达从而增强肺癌干细胞特征。免疫印迹结果表明,与对照相比,暴露于尼古丁的Ad/CFTR感染的A549细胞中CFTR蛋白显著减少(p<0.01)。免疫荧光染色进一步揭示了尼古丁使A549细胞膜和细胞质中CFTR的表达明显减少,这些结果表明尼古丁可以抑制A549细胞中CFTR蛋白的表达和功能。CCK8实验、细胞划痕实验、Transwell实验、克隆形成实验检测CFTR对A549细胞增殖,迁移和侵袭克隆形成能力的影响,与对照细胞相比,暴露于尼古丁的细胞显示出较低的增殖能力,表明200 nm/L浓度的的尼古丁在A549细胞中表现出边缘毒性,而200nm/L浓度的尼古丁显示出增强A549细胞的细胞迁移侵袭和克隆形成的能力,并且,无论是否存在尼古丁,CFTR的过表达都显着抑制了A549细胞迁移侵袭和克隆形成的能力(p<0.01),相反,通过shRNA敲低CFTR显示出在A549细胞中迁移侵袭和克隆形成的效力显着增强(p<0.01),这些结果表明,CFTR能够抑制A549肿瘤细胞转移特征。通过Westernblot检测干细胞相关转录相关因子的表达情况,与用Ad/CFTR和Ad/BgLII对照感染的细胞相比,尽管许多推测的干细胞相关蛋白质未检测到明显改变,但是在Ad/CFTRi感染的A549细胞中观察到明显增加的CD133,OCT3/4蛋白丰度。将A549细胞用Ad/BgLII(BgLII),Ad/CFTR(CFTR)和Ad/CFTRi(CFTRi)感染24小时,然后将它们暴露于尼古丁或对照另外24小时,然后收获细胞用于ALDH染色和流式细胞术分析,没有尼古丁处理组和用尼古丁处理组的细胞,与Ad/BgLII感染的细胞相比,流式细胞术数据的定量分析显示CFTR没有明显改变A549细胞中ALDH阳性细胞组分比例(p>0.05)。为了进一步研究CFTR与肺腺癌的表达和功能的临床相关性,通过RT-PCR分析方法评估人肺组织及其匹配的肿瘤相邻肺组织和肺腺癌患者正常肺组织中CFTR转录物的相对丰度,然而,与肺腺癌患者的正常肺组织(p=0.0107)和肿瘤相邻组织(p=0.0053)相比,在肿瘤组织中检测到更丰富的CFTR转录物,但是在正常肺组织和肿瘤相邻组织之间未观察到统计学差异。结论:1.尼古丁能够抑制A549细胞CFTR蛋白的表达量。2.CFTR能够降低A549细胞的迁移和侵袭能力。3.CFTR抑制A549细胞的克隆形成能力。4.CFTR抑制A549细胞中干细胞相关转录因子和CD133的表达。