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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属于嗜肝DNA病毒科。HBV感染除了导致急、慢性肝炎外，还与肝硬化(hepatic cirrhosis)和肝细胞癌(Hepatocarcinoma carcinogenesis，HCC)的发生密切相关，严重危害人民的健康，在治疗上缺乏理想的抗病毒药物。重组干扰素(INF-γ)、核苷类似物如拉米夫定(lamividine)等药物因疗效和副作用等各种问题限制了临床应用；反义寡核苷酸(antisenceoligonucleotide，ASON)、核酶(ribonuclease，RNase)以及脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)等基因治疗的研究因许多难以克服的问题而难以深入进行，仍需探索新型有效的抗HBV感染的药物和方法。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物体内普遍存在的一种基因表达的调控机制，基于此理论的RNAi技术具有普遍性、高特异性和高效性等特点，已经广泛应用于基因功能研究和感染性疾病、恶性肿瘤等疾病治疗的研究。RNAi的关键是细胞内的Dicer酶切割dsRNAs产生21-23核苷酸(nucleotide，nt)的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)，siRNA可介导对细胞靶mRNA特异性的降解导致基因表达的转录后沉默。体外合成siRNA用于转染哺乳动物细胞，可避免长的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)(>30nt)所产生的干扰素反应(interferon response)，同时具有合成方便快捷、转染效率高、沉默效果迅速等优点。
HepG2.2.15细胞是体外研究HBV复制较为理想的细胞感染模型。HepG2.2.15细胞是来源于HepG2细胞，整合了ayw型HBV全基因组，能够部分模拟HBV的生活周期，表达各种HBV产物并能分泌HBV Dane颗粒的稳定的人类肝癌细胞株，更接近于人体肝细胞内环境的实际情况，被研究者广泛应用于HBV复制的研究。
本实验应用化学合成siRNA经阳离子脂质体转染HepG2.2.15细胞，通过检测细胞培养上清中HbsAg和HbeAg浓度、DNA拷贝数、细胞内mRNA等核酸和蛋白的表达水平评估RNAi作为一项新技术应用于抗HBV感染的价值，为进一步动物实验乃至应用于临床提供理论基础和实验依据。实验方法和结果如下：
一、HepG2.2.15细胞内HBV S基因的鉴定
1.HepG2.2.15细胞的培养HepG2.2.15细胞在含10﹪胎牛血清(FCS)的DMDM培养基中(含青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，G418 380ug/ml)，37℃，5﹪C02培养。3-4天换液一次，6-7天传代一次。
2.HepG2.2.15细胞病毒抗原分泌规律 HepG2.2.15细胞接种后第一天在培养液上清中即可检测到抗原分泌，随着培养时间延长，病毒抗原分泌量逐渐增加，至接种后第6-9天达到高峰，此后抗原分泌逐渐趋于稳定。
3.HepG2.2.15细胞内HBV的鉴定针对HBV S区合成引物PCR扩增所得片段琼脂糖凝胶电泳结果大约在600bp的位置，与预期结果相符；测序结果与GeneBank中HBV序列进行BLAST比对，与序列号U95551的基因序列完全一致。
二、siRNA的设计合成及其转染条件的优化
1.siRNA序列的合成根据GenBank中报道的HBV核苷酸序列(U95551)，参考siRNA的设计原则，在siRNA设计网站http：//www1.qiagen.com/Produets/GeneSilencing/CustomSiRna/SiRnaDesigner.aspx，确定P+S区(1805-1826)、P+X区(413-434)两个位置作为干扰靶点并对其进行MFOLD二级结构分析，将针对此靶点设计出的siRNA靶序列进行BLAST(http：//www.ncbi.ntm.nih.gov/blasV)同源分析证实为HBV特异序列。针对该靶序列分别合成siRNAs，并筛选出有效序列。
2.siRNA转染的优化通过对在不同时间、不同细胞密度、不同siRNA与脂质体的比例情况下的转染得到如下结果：细胞传代后24h-48h，达到20-30﹪汇合度时进行转染效果最好：转染时siRNA与脂质体比例为2.5ul.1ul时所获得的干涉效果最佳。
三、siRNA对HBV复制和表达的抑制作用
1.siRNA对病毒蛋白表达的特异性抑制作用本实验针对HBV的P+S区(1805-1826)、P+X区(413-434)设计合成的2个siRNAs转染细胞后，对HBV的蛋白表达表现出不同的抑制作用。对转染24h、48h、72h的细胞上清中HBsAg、HBeAg的表达均有强弱不等的抑制作用，72h抑制率达高峰；2个siRNAs对HBsAg的抑制率分别为81﹪、78﹪，对HBeAg的抑制率分别为35﹪、49﹪。
2．siRNA对细胞内HBV mRNA的抑制作用提取转染后的HepG2.2.15细胞内总RNA，RT-PCR检测显示，实验组比对照组条带明显减弱，在20nM、60nM、120nM等不同浓度下，抑制率随着浓度的增大而增大，提示siRNA对HBV的抑制效果呈剂量依赖性。
3．siRNA对细胞内HBV DNA的抑制作用检测转染后HepG2.2.15细胞上清中HBV DNA的拷贝数，抑制率达到30﹪-60﹪，并随时间的延长而增大，提示siRNA对HBV的抑制呈时间依赖性。
4．siRNA对细胞形态和生长状况的影响转染后的HepG2.2.15细胞内HbsAg、HbeAg减少；MTT检测显示，细胞光吸收度随siRNA浓度的增大而减小有显著性差异，表明siRNA对细胞生长有一定影响。
总之，本研究针对HBV两个不同位点设计的siRNA转染细胞后，能够在HepG2.2.15细胞内抑制HBV DNA的复制及多种HBV蛋白的表达，siRNA的抗HBV效应具有高效性、剂量依赖性和时间依赖性，有望为抗HBV感染提供一种新型的治疗方法。