免疫球蛋白(Ig)是人体免疫系统的重要组成部分,发挥着识别中和细菌、病毒以及活化补体的作用。人血浆中的免疫球蛋白有5种类型,主要是r-球蛋白,即IgG。IgG最显著的特点是能够特异性地识别抗原,并与之结合形成复合物,复合物被吞噬细胞吞噬后,使抗原失去毒性和致病性。目前,临床上主要采用静脉注射免疫球蛋白作为免疫疾病的治疗药物,且用药适应征和药品用量都在不断地增加,由于原料血浆限制,目前免疫球蛋白的生产企业和产量有限,不能满足临床的需求,因此寻找免疫球蛋白增产的途径具有重大的社会和经济意义。血液制品是由健康的人血浆或经特异免疫的人血浆经分离、提纯或运用重组DNA技术制得的血浆蛋白的组分,以及血液细胞的有形成分的统称。按照结构和功能方面的不同,血液制品分为三大类,分别为白蛋白、免疫球蛋白和人凝血因子。其中,免疫球蛋白制品根据使用方式的不同分为肌注型和静注型,另外还有由特异免疫血浆制备的特异性免疫球蛋白。从人血浆中分离纯化的血液制品具有纯度相对高、安全性好、生物活性强和稳定性较高的优点。目前国内外获取免疫球蛋白主要是从血浆或相关组分Ⅱ+Ⅲ或相关组分Ⅰ+Ⅱ中纯化制备,鲜有从Ⅰ+Ⅲ中提取制备的,主要是因为组分Ⅰ+Ⅲ组成复杂,分离提纯难度大,不易分析。但经过试验和参考文献证实,组分Ⅰ+Ⅲ中确实含有一定量的IgG,大有可回收的价值。目前,国内主要有低温乙醇法、离子交换层析法、辛酸盐沉淀非IgG类蛋白等方法从组分Ⅰ+Ⅲ中分离IgG。本课题拟研究建立从血浆分离的组分Ⅰ+Ⅲ中纯化免疫球蛋白G的规模化制备工艺。经过工艺研究,确定采用去除杂蛋白的辛酸沉淀法进行层析前处理,再用阴离子交换层析技术吸附杂蛋白,获得高纯度的IgG原液。本试验用辛酸沉淀的方法提取IgG,既提高了收率,又对脂蛋白有较好的沉降效果,能够延长凝胶的寿命。同时,辛酸具有灭活脂包膜病毒的作用,降低了病毒传播的风险。通过缓冲液浓度、pH、温度、正辛酸的用量、固液比例五个因素进行正交试验,确定了IgG纯度和收率最佳的组合条件,即：醋酸-醋酸钠缓冲液浓度是20mmol/L;固液比例是3倍；溶解液的pH值是4.5；溶解的温度是7℃；加入辛酸的量是16ml/L,选用GE公司提供的Macro Cap Q作为阴离子交换介质,将层析前样品pH调整到5.8±0.05,电导率值调整到1.5±0.05mS/cm,可达到纯化的目的。通过纳米膜过滤达到去除病毒的目的。试验分析了蛋白质浓度、pH、电导率、保护剂浓度对纳米膜的影响。经过多重比较,发现保护剂对过滤效果影响不大,确定了纳米膜过滤最优组合为蛋白质浓度为4mg/ml、pH值为6.0、电导率为5.3mS/cm。根据样品检测结果可以看出,该工艺生产的静注人免疫球蛋白产品多项指标均优于2010版《中国药典》的标准规定,IgG纯度明显高于《中国药典》和《欧洲药典》的要求,IgG单体+二聚体≥99.0%,高于《中国药典》95%的规定。与市售静注人免疫球蛋白产品的质量对比,本工艺生产的静注人免疫球蛋白产品各项质控指标均不低于同类市售产品水平。本研究取得的成果和结论：(1)通过测定血浆分离组分废弃物中IgG,发现低温乙醇沉淀组分Ⅰ+Ⅲ—步就损失约16%的IgG,有必要以组分Ⅰ+Ⅲ为原料回收IgG；(2)通过对从Cohn氏组分Ⅰ+Ⅲ中回收IgG层析前处理工艺的优化,确定使用辛酸沉淀法、再用阴离子交换层析法可获得高纯度的IgG原液；(3)建立了人免疫球蛋白Macro Cap Q层析工艺,筛选确定了提高人免疫球蛋白单体+二聚体纯度和收率的最佳层析条件；(4)优化了纳米膜过滤工艺,确定了最优组合条件,降低了病毒灭活的成本；(5)本工艺提取的IgG制品,其纯度、蛋白质浓度、抗补体活性、IgG亚类分布等药典规定和其他必须的检测项目均不低于同类市售产品水平；(6)建立了从组分Ⅰ+Ⅲ中回收IgG的生产工艺,为中试放大提供了基础。