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研究目的：本课题根据“癌毒学说”,旨在研究虎眼万年青总皂苷对乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响,对细胞MAPK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白与基因的表达调控作用,以初步探讨虎眼万年青抗乳腺癌的有效分子作用机制。研究意义：为抗癌毒新药的进一步研发及抗癌解毒治则的合理应用提供必要的理论与实验依据。研究方法：1、采用MTT比色法检测ORS对ER(+)人乳腺癌MCF-7细胞与ER(一)人乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖的抑制效应,筛选出敏感细胞、各自的有效作用剂量和有效作用时间,并判定效量、时效关系；2、倒置显微镜观察25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、400μg/mL ORS作用于ER(+)人乳腺癌MCF-7细胞与ER(一)人乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后对细胞形态学的影响；透射电镜观察100μg/mL ORS作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后,细胞形态、结构的变化,以及是否出现核质浓缩,凋亡小体、染色质边集等现象；3、Annexin V-FITC染色流式细胞仪检测25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL ORS作用人乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后对细胞凋亡的影响；4、流式细胞仪分析100μg/mL ORS作用人乳腺癌MDA-MB-231细胞12h、24h、48h后对细胞周期的影响；5、Western Blotting法检测100μg/mL ORS作用人乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后凋亡相关的Bcl-2、Bax、Bad蛋白的表达情况；以及分别加入MAPK通路激动剂、MAPK各主要通路抑制剂后各处理组的ERK、JNK、P38磷酸化蛋白与总蛋白的表达情况,以探讨ORS对MAPK信号通路的调控作用；6、实时荧光定量PCR法检测25μg/mL、100μg/mL、400μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后凋亡相关bax mRNA、Bcl-2mRNA、bad mRNA的表达情况。研究结果：1、当ORS的剂量逐渐增加与用药时间的逐渐延长后,对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用逐渐增强；在剂量为12.5μg/mL,时间为72h组,剂量为25μg/mL,时间为48h、72h组,以及剂量为50-400μg/mL的三个时间段各组别的抑制率与阴性对照组比较,均具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。2、倒置相差显微镜下观察显示：用药组的MDA-MB-231细胞随ORS剂量的逐渐增加,形态逐渐皱缩变圆,漂浮,细胞密度逐渐减少,间隙逐渐增大,胞浆颗粒增多,增殖变慢,甚则细胞裂解为若干碎片；正常对照组MDA-MB-231细胞呈饱满梭形贴壁生长,细胞轮廓清楚,排列紧密,细胞生长旺盛。透射电镜观察显示：100μg/mL ORS作用人乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后发生体积皱缩,细胞表面绒毛减少,核膜消失,核质萎缩、碎裂,个别形成凋亡小体；部分染色质固缩,沿核膜形成数个团块状边集；细胞器外渗、肿胀,空泡状明显增多。正常对照组细胞膜表面光滑、完整,可见微绒毛,胞质密度高,无空泡,核内染色质分布均匀、核仁大较完整,居中或边移；细胞器亚微结构较清晰、完整。3、人乳腺癌MDA-MB-231细胞经过不同剂量的ORS处理48h后,各剂量ORS组均出现不同程度的凋亡,且细胞的凋亡比例在早、中晚期均呈现出随剂量增高而增长的态势。各剂量ORS组细胞的总凋亡率与正常对照组比较,差异均有显著统计学意义(P<0.01)；各剂量ORS组两两比较总凋亡率,除25μg/mL组与50μg/mL组之间无统计学意义外(P>0.05),其余组间均具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4、100μg/mL的ORS作用于人乳腺MDA-MB-231细胞后,与正常对照组比较,ORS组G0/G1期的细胞比例随作用时间延长在逐渐增加,而S期的细胞比例随作用时间延长在逐渐减少,细胞的增殖被明显地阻滞于G0/G1期,表明ORS对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖周期的影响具有时间依赖性。5、1)100ng/mL ORS单独作用MDA-MB-231细胞48h后, p-ERK蛋白表达较正常对照组比较出现明显减弱,具有显著统计学差异(P<0.01),p-JNK通路蛋白及p-P38蛋白的表达较正常对照组均明显增强,均具有显著统计学差异(P<0.01)。2)100μg/mL ORS分别与三种通路抑制剂联合作用于MDA-MB-231细胞后,①从ERK通道层面来观察, ERK抑制剂(PD98059)联合组作用于细胞后,p-ERK蛋白表达较正常对照组与单独ORS组均呈现进一步减弱趋势,均具有显著统计学差异(P<0.01),而P38抑制剂(SB203580)联合组与JNK抑制剂(SP600125)联合组处作用于细胞后,p-ERK蛋白表达较正常对照组都有减弱趋势,前者有统计学差异(P<0.05),但较ORS单独作用组而言则出现了p-ERK蛋白表达增强的态势,二者均有统计学差异(P<0.05)；②从JNK通路层面来观察,ORS作用经三种抑制剂处理过的细胞后,p-JNK蛋白的表达较正常对照组均出现了增强趋势,其中P38抑制剂联合组与ERK抑制剂联合组有统计学差异(P<0.05),但较ORS单独作用组则出现了减弱态势,JNK抑制剂联合组有统计学差异(P<0.05)；③从P38通路层面来观察,ORS作用经三种抑制剂处理过的细胞后,p-P38蛋白的表达较正常对照组也均出现了增强的趋势,有明显统计学差异(P<0.01),较ORS组而言仍然均呈现出减弱态势。3)随着ORS浓度的增加,三个剂量的ORS作用MDA-MB-231细胞48h后,Bax蛋白的表达均不明显,无统计学差异(P>0.05),但Bcl-2蛋白的表达均下调,其中100μg/mL与400μg/mL组较正常对照组有显著统计学性差异(P<0.01)；纵观Bax蛋白/Bcl-2蛋白,100μg/mL与400μg/mL组较正常对照组均呈上升,有显著统计学差异(P<0.01)；而Bad蛋白的表达是随ORS浓度的增加而逐渐增强,三个剂量组较正常对照组均具有显著统计学差异(P<0.01)。6、100μg/mL ORS作用MDA-MB-231细胞48h后对Bax mRNA的表达量上调,较正常对照组有显著统计学差异(P<0.01),25μg/mLORS作用组与10O0μg/mLORS作用组的Bcl-2mRNA的表达较正常对照组均呈下调,其中25μg/mL作用组有显著统计学差异(P<0.01),纵观Bax mRNA/Bcl-2mRNA,25μg/mL与100μg/mLORS作用组较正常对照组均呈上调,其中100μg/mL作用组有统计学差异(P<0.05)；100μg/mL与400μg/mLORS作用组对Bad mRNA的表达较正常对照组均呈明显上调,均有显著统计学差异(P<0.01)。研究结论：1、ORS具有抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用,且抑制效应呈明显的量效与时效关系,其机制可能与ORS通过ERK/MAPK途径影响了cyclinD的过度表达,使得细胞增殖被阻滞于G0/G1期相关。2、ORS能够诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡,并引起细胞发生相应的凋亡形态学改变,其机制可能与ORS对MAPK信号转导通路的ERK、JNK、P38途径的综合调控有关,ORS的作用位点可能位于ERK、JNK、P38信号通路的上游,或者由其它信号转导通路的介入而产生的互联调控效应；并且在细胞凋亡过程中显示出ORS诱导MDA-MA-231细胞凋亡的效应与JNK、P38的通路的激活成正相关,而与ERK通路的激活呈负相关。3、ORS诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡的机制也可能与ORS调控Bcl-2家族的Bax、Bcl-2、Bad蛋白以及Bax mRNAx、Bcl-2mRNA、Bad mRNA的综合表达有关。其总的调节趋势为抑凋亡Bcl-2蛋白表达减弱,总Bax蛋白/Bcl-2蛋白上升,促凋亡Bad蛋白表达增强；抑凋亡基因Bcl-2mRNA表达下调,总Bax mRNA/Bcl-2mRNA上升,促凋亡Bad mRNA表达上调。