钾通道是生物体内种类最多、分布最广的一类离子通道,它在细胞静息膜电位的维持、动作电位的形成、细胞增殖、细胞凋亡等生理和病理活动中都发挥着重要的功能。因此,鉴定新型的钾通道调节剂对于钾通道结构与功能的研究及相关疾病治疗具有重要的意义。本论文拟从两个方面挖掘新型的钾通道抑制剂,一方面从防御素多肽资源库中挖掘;另一方面,从与钾通道疾病相关的治疗药物中挖掘。防御素是一类广泛存在于不同生物中的抗微生物多肽。2015年,我们研究团队首次报道了抑制钾通道电流的防御素—人β防御素(Feng,Yang et al.2015,Yang,Feng etal.2015)。在此基础上,我们对人源防御素与钾通道相互作用开展了更加广泛的研究。在序列比对和空间结构分析的基础上,我们选择了人源α防御素HNP1和HD5作为研究对象,通过膜片钳技术检测了它们对钾离子通道的作用,结果发现HNP1和HD5都能选择性作用钾离子通道Kv1.3,它们对Kv1.3通道的半数抑制浓度分别为102.0±30.3nM和2.2±0.2μM;HNP1和HD5对其它几种类型的钾通道Kv1.2、KCNQ1、IKCa和hERG通道都没有明显的抑制效果。HNP1不仅可以抑制HEK293T细胞上表达的Kv1.3通道,还可以抑制人原代CD3+T细胞上Kv1.3通道电流,而且还能抑制细胞因子IL-2的分泌,表明了它在免疫系统中的新功能。虽然防御素HNP1和HD5具有相似的三维空间结构,但是它们与Kv1.3通道作用的机制并不相同:HNP1可以同时结合到Kv1.3通道的S1-S2linker和孔区两个位点,而HD5仅结合到Kv1.3通道的孔区,HNP1结合到S1-S2 linker上会使Kv1.3通道的激活曲线向右偏移9.5 mV以及在不同电压下的激活时间常数增大;而HD5对Kv1.3通道的激活动力学过程没有影响。这些结果表明人源α防御素是一类新型的Kv1.3通道内源性抑制剂,并且它们与Kv1.3通道作用的机制具有显著的差异性。人源防御素HNP1、HD5和hBD2都选择性作用免疫相关的Kv1.3通道,对其它类型钾通道的抑制效果都不明显。为了调查这是否是人防御素与钾通道相互作用的共性,本论文进一步调查了人β防御素hBD3与钾通道Kv1.3的相互作用。实验结果发现hBD3同样能抑制Kv1.3通道,其对Kv1.3通道的半数抑制浓度为187.6 ± 25.7 nM。hBD3和hBD2与Kv1.3通道的作用具有不同的机制:hBD2不仅能以堵孔作用结合到Kv1.3通道的孔区,还能结合到S1-S2 linker上作为门控调节剂影响Kv1.3通道的电压传感器的运动,从而影响通道的激活过程;hBD3只能通过孔区作用Kv1.3通道,对通道的激活动力学没有影响。另外,与hBD2高度选择性作用Kv1.3通道不同,hBD3还能抑制钾通道Kv1.2、KCNQ1和hERG的电流,在1 μM的浓度下对这三种钾通道的抑制效果分别为:50.6 ±3.6%、29.9± 1.2%和33.6± 1.0%。这些结果表明防御素与钾通道作用的机制具有多样性。甲氨蝶呤是目前临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症等自身免疫性疾病的小分子化学药物,而目前研究表明了淋巴细胞上Kv1.3通道是治疗自身免疫性疾病的新靶标。通过结构与性质分析,我们推测甲氨蝶呤可能是钾通道Kv1.3的新型抑制剂。实验结果表明甲氨蝶呤能够抑制Kv1.3通道电流,在1 μμM的浓度下对Kv1.3通道的抑制作用能达到79.9 ± 1.54%,其半数抑制浓度为41.5 ± 24.9 nM;另外,它在1 μM浓度下还能分别抑制32.6 ± 1.3%,25.6%±2.2%的Kv1.1和Kv1.2通道电流;而对其他几种钾通道KCNQ1、SKCa3、IKCa和hERG没有明显的抑制效果。嵌合体和突变体的结果表明MTX通过孔区作用Kv1.3通道,Turret上的Asp371、Thr373以及选择性过滤器上方的His399在它们作用的过程中发挥着重要的作用。由于钾通道Kv1.3和自身免疫性疾病密切相关,因此甲氨蝶呤也可能通过对Kv1.3通道的抑制作用来进一步达到其治疗效果。这些发现揭示了甲氨蝶呤治疗自身免疫性疾病的新机制。综上所述,我们鉴定到人α防御素HNP1和HD5都能选择性抑制Kv1.3通道,并且HNP1和HD5与Kv1.3通道作用具有不同的机制;人β防御素hBD3同样可以通过孔区抑制Kv1.3通道;与其它作用钾通道的防御素不同,hBD3还能抑制Kv1.2、KCNQ1和hERG通道电流;另外,我们还发现治疗自身免疫性疾病的药物MTX可以抑制Kv1.3通道,嵌合体和突变体实验表明它通过孔区作用Kv1.3通道。本论文工作扩大了钾通道抑制剂的家族,揭示了它们新的生物学功能,深化了人们对钾通道抑制剂结构与功能多样性的认识。