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双歧杆菌是人体肠道常见的共生微生物,一些双歧杆菌具有良好的益生保健功效,作为益生菌广泛应用于发酵乳制品的生产。双歧杆菌经口摄入后,最终定植于含有0.05%-2.0%胆盐的大肠中。胆盐具有杀菌作用,能够破坏细菌的细胞膜结构,进而引起蛋白质错误折叠和DNA氧化损伤等危害,因此耐受生理条件下的胆盐胁迫是双歧杆菌在人体发挥益生作用的必要条件。本研究采用转录组学和蛋白组学技术相结合的手段,筛选了Bifidobacterium longum BBMN68胆盐胁迫反应中的差异表达基因和蛋白质,并对其中部分基因进行了功能验证,研究结果揭示了B.longum BBMN68的胆盐胁迫应答机制,研究内容如下：(1) B. longum BBMN68胆盐胁迫条件下转录组和蛋白组图谱的建立。以含有0.075%牛胆盐(ox-bile)的培养基模拟人体肠道环境的胆盐胁迫条件,应用基于第二代高通量测序的RNA-Seq方法筛选了236个转录水平显著变化(≥3.0倍,p<0.001)的基因,同时利用2-DE和质谱鉴定分离了44个胞内可溶性差异表达蛋白(≥1.6倍,p<0.01),其中15个基因的表达在转录和翻译水平同时上调或下调,结果表明B. longum BBMN68的胆盐胁迫应答是一个复杂的代谢调控网络。(2)生物信息学分析揭示B. longum BBMN68的抗胆盐胁迫反应机制。通过GO和COG聚类分析显示胆盐胁迫条件下的差异表达基因和蛋白参与菌体生理代谢的各个方面,进而利用NCBI、UniProt和KEGG数据库对差异表达基因和蛋白质的功能进行分析,提出了双歧杆菌的抗胆盐胁迫反应机制。一是胆盐抗性机制,包括胆盐水解酶、胆盐泵出转运体系以及一些阻止胆盐入侵的膜蛋白；二是胆盐适应机制,涉及普遍胁迫应答、多个中心代谢途径(例如双歧支流糖代谢、氨基酸、核苷酸和脂肪酸的合成)、跨膜转运、基因转录和翻译进程、以及菌体的分裂增殖等。(3)胆盐作为肠道环境信号促进B. longum BBMN68与宿主间相互作用。B. longum BBMN68感应胆盐信号,提高分选酶(sortase A)的表达,分选酶促进菌毛结构和一些表面蛋白锚定于细胞壁上,可能与菌体的粘附特性相关。菌体自聚集和细胞粘附实验表明,胆盐胁迫条件下BBMN68菌体自聚集程度下降,同时对HT-29细胞的粘附能力提高了5倍,结果证实胆盐能够促进BBMN68对人体肠道的粘附定植。同时,自诱导剂-2(AI-2)的合成受胆盐诱导,促进了B. longum BBMN68与其他肠道细菌的相互作用。此外,氨基糖苷核苷转移酶的上调表达赋予了B. longum BBMN68对氨基糖苷类抗生素的抗性,有利于其在长寿老人肠道中的长期定植。(4)双组分系统SenX3-RegX3在B. longum BBMN68胆盐胁迫反应中的调控作用。利用细菌单杂交和MEME分析工具预测了响应调节蛋白RegX3的DNA识别位点GARRACY,通过Target Explorer筛选了9个SenX3-RegX3的靶基因,进一步用体外EMSA验证了该双组分系统对pstS基因的调控；利用乳酸乳球菌NICE表达系统异源超量表达pstS,重组菌株的胆盐耐受能力显著提高。结果表明双组分系统SenX3-RegX3能够感应胆盐胁迫信号,并激活pstS基因的表达,通过提高Pi摄取以加速体内ATP的积累,从而赋予菌体更高的抗胆盐胁迫水平。综上所述,本研究首次采用了转录组学和蛋白组学相结合的方法,全面分析了B. longum BBMN68胆盐胁迫条件下的基因转录和蛋白质表达情况,研究结果不仅为揭示双歧杆菌的抗胆盐胁迫反应提供了新的依据,也为深入研究其胆盐胁迫应答机制提出了新的思路。