合理使用抗生素能够治疗人类和动物的感染性疾病,然而临床中滥用和过度使用抗生素加剧了耐药菌的出现,甚至“超级细菌”的产生。超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)主要是质粒编码的一类酶,能够水解青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素,但不能水解头霉素类(如头孢西丁、头孢替坦)或碳青霉烯类,可被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。全球流行的ESBLs主要包括SHV型、TEM型和CTX-M型。CTX-M型是目前最主要的β-内酰胺酶类型。ESBLs主要在肠杆菌中发现,肠杆菌是人和动物肠道内正常菌群,也是院内和社区感染的重要病原体。人和动物源的耐药菌通过排放最终进入到水环境中,其耐药基因可能在水环境的细菌之间进一步扩散。水被认为是耐药基因重要的存储库。因此,一旦产ESBL肠杆菌通过污染的食物或饮用水进入到人和动物肠道内,很可能导致耐药基因在人和动物体内传播,甚至造成严重的感染。质粒在肠杆菌之间具有潜在的转移能力,很可能导致超级毒力或耐药菌株出现,在耐药性的进化和散播过程中起着重要的作用,但至今其转移机制尚不明确。为了了解不同水环境中产ESBL肠杆菌的流行情况及其来源,以及携带ESBLs的耐药质粒在小鼠肠道内水平转移的分子机理,我们开展了以下研究。1.泰安农村井水中产ESBL肠杆菌的流行及特点为了解泰安农村井水中产ESBL肠杆菌的流行及特点。从4/100(4%)个采样井中,共分离到10株产ESBL肠杆菌,包括9株大肠杆菌和1株肺炎克雷伯菌。ESBL基因型结果显示9株菌为CTX-M-15,1株菌为CTX-M-27。5/8株CTX-M-15产ESBL大肠杆菌属于ST10,在人粪便中经常检测到。值得注意的是,仅有1株CTX-M-27型大肠杆菌的多位点序列分型属于B2:131(ST131),可能与人类和动物的严重感染有关。2.馆陶地区农村蓄水池中产ESBL肠杆菌的多重耐药性对馆陶地区农村蓄水池中产ESBL肠杆菌进行分离并分析其特点。采集的30个蓄水池中,有5个(16.7%)分离检测到产ESBL肠杆菌。本研究中分离到66株ESBL表型阳性的非重复性菌株。菌种鉴定结果为42株为大肠杆菌,17株为肺炎克雷伯菌,4株植生拉乌尔菌、3株阴沟肠杆菌。20株菌含有单一的bla基因,包括CTX-M型(17株)、TEM(2株)和SHV(1株);46株菌同时含有两种或三种bla基因。所有产ESBL肠杆菌均表现多重耐药性。这些结果表明馆陶地区的农村蓄水池已被产ESBL肠杆菌严重污染。3.泰安黄前水库中产esbl耐热肠杆菌的耐药性及整合子特点我们以产esbl耐热大肠菌(extended-spectrumβ-lactamases-producingthermotolerantcoliforms,esbl-tc)为指示菌,对泰安黄前水库中分离的esbl-tc的耐药性、bla基因型、整合子(1、2、3类)及基因盒的特点进行分析。共分离到96株非重复性esbl-tc菌株,esbl基因包括blactx-m-14(n=47),blactx-m-15(n=27),blactx-m-55(n=18),blashv-12(n=4),blactx-m-3(n=3),andblactx-m-123(n=1)。其中83株含有1类整合子(86.5%),2株含有2类整合子,整合子基因盒的大小在0.2kb至3.2kb之间。该结果表明,黄前水库已被esbl-tc严重污染,成为耐药基因的储存器。4.泰安健康农村居民中粪便携带ctx-m型产esbl肠杆菌的高流行率及风险因素分析为了解泰安地区农村健康居民粪便中ctx-m型esbl肠杆菌科细菌的携带情况及相关风险因素。从农村居民中共收集620份粪便样本,筛选ctx-m阳性肠杆菌,并应用标准统计方法对粪便携带的相关风险因素进行分析。458株携带ctx-m的肠杆菌(458/620,73.9%)分离于不同的人,最主要的基因型为ctx-m-9组(303/458,66.2%)。携带ctx-m基因的肠杆菌中,主要为大肠杆菌(403/458,88%)和肺炎克雷伯菌(26、458、5.7%)。所有ctx-m阳性菌株都对氨苄西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松耐药,但都对比阿培南、亚胺培南、美罗培南敏感。多变量逻辑回归模型分析结果:受正规教育(or2.321;95%ci1.302–3.768;p=0.039),过去6个月内的住院情况(or1.753;95%ci1.127–2.584;p=0.031)和过去6个月内抗生素的使用(or1.892;95%ci1.242–2.903;p=0.034),这三个变量与ctx-m型产esbl阳性菌株携带者具有显著相关性(x2=21.21;df=3;p<0.001)。泰安市健康农村居民的粪便携带ctx-m型产esbl肠杆菌粪便的流行率高,主要与近期抗生素的使用和住院情况有关。5.从猪和养殖工作人员分离的产esbl大肠杆菌的特性食品性动物一直被认为产esbl大肠杆菌的存储器。为分析和比较猪源与猪场工作人员中携带的产esbl大肠杆菌的特点,从4个育肥猪场中采集60头猪的肛门棉拭子(15个样品/猪场),并采集40个猪场工作人员的直肠棉拭子(10人/猪场)。从以下几个方面对分离的产esbl大肠杆菌进行分析:esbl基因型,耐药谱,eric和多位点序列分型。自60份猪肛门棉拭子中分离到34株产esbl阳性大肠杆菌,20.0%(8/40份)的工作人员棉拭子为产esbl大肠杆菌阳性。更重要的是,同一猪场内猪源和工作人员中分离到的产esbl大肠杆菌菌株具有相同的β-内酰胺酶基因、耐药谱、eric型以及相同的st型。结果表明在动物与人之间可能存在产esbl大肠杆菌的传播。6.esbls耐药质粒全序列分析编码esbls基因通常位于质粒上,并通过接合、转座作用转移和传播。我们挑选了一株水源携带ctx-m-15基因的大肠杆菌w121,进行体外耐药质粒接合转移,并对质粒dna全序列分析。携带的ctx-m-15耐药性质粒tp采用鸟枪法构建文库方法进行dna测序并利用生物信息学方法分析了其编码基因和结构。质粒tp全长为94495bp,属于inci1质粒不相容性分组。质粒全序列上共含有116个预测基因,仅携带两个已知耐药基因blactx-m-15和blatem-1。tp的基本结构与质粒r64非常的相似,骨架之间共线性主要位于转移区域,并且同样含有大肠杆菌素ib基因。耐药质粒tp可看作由转座子tn3介导的isecp1-blactx-m-15相关元件嵌合体。类似tp质粒上两个不同β-内酰胺酶基因的同时转座,会导致耐药基因的广泛传播,具有重要的公共卫生学意义,需进一步研究。7.水源产esbl大肠杆菌在小鼠肠道内滞留应用小鼠肠道定植模型,检测水源产esbl大肠杆菌耐药基因在体内的定植能力以及抗生素对产esbl大肠杆菌在肠道内滞留的影响。小鼠接触的饮用水污染浓度越高,耐药菌在肠道内滞留的时间越长,但最终会低于检测水平。在抗生素(头孢菌素)处理的小鼠中,水源大肠杆菌在肠道内定植水平为108cfu/g;未给予抗生素的小鼠中,由于小鼠肠道固有菌群的定植拮抗作用,耐药菌迅速下降至检测限以下,但再给予抗生素治疗后,耐药菌直接达到可检测水平并上升至108cfu/g粪便。此外,在小鼠肠道内定植期间可检测到耐药质粒的转移,blactx-m和blatem基因可同时转移至肠道固有肠杆菌中。总之水源耐药大肠杆菌能够很好地在肠道内定植,携带的质粒在体内具有转移能力。抗生素治疗有利于耐药菌的选择生长及肠道内的定植,增强了耐药基因库,最终提高了耐药基因的传播风险。8.水源产esbl大肠杆菌耐药基因在炎症小鼠肠道内的水平转移首先建立小鼠肠道炎症模型。在沙门氏菌感染的链霉素处理小鼠模型中,小鼠肠道炎症促进了供体菌(108-1011cfu/g粪便)和受体菌(108-1010cfu/g粪便)在肠道内的共同大量增值。在大量增值的状态下,检测供体菌与受体菌之间质粒tp的转移接合率,结果发现接合菌(tcs)几乎等于受体菌在肠道内的水平,且转移率高达近100%,显著高于正常肠道组。说明在5dpi几乎所有的受体菌都接受了质粒成为tcs。在正常肠道小鼠模型中,由于肠道内定植拮抗,供体菌、受体菌的水平显著低于肠道炎症组小鼠,接合菌的水平也远远低于受体菌。总之,炎症引发肠道内肠杆菌的大量繁殖,使得供体菌和受体菌的密度比正常哺乳动物肠道内提高了100多倍。这促进了不同肠杆菌之间遗传物质的重排和转移,表明感染的病人体内更容易发生质粒编码的耐药因子的扩散转移(如ESBL)。9.水源产ESBL大肠杆菌在小鼠肠道内质粒水平转移的分子机制哺乳动物肠道内含有大量的微生物菌群,这些微生物菌群可以通过质粒水平转移的方式与入侵微生物之间进行基因的交换,导致超级毒力或耐药的菌株出现,但至今其转移机制尚不明确。为了更确切地证明是否在水源大肠杆菌(E.coli W121)与肠道固有大肠杆菌之间发生了质粒水平转移,以及从分子生物学角度探讨其水平转移的机制。首先利用生物信息学将Tp质粒与固有大肠杆菌(EC615)所接受的质粒比较,发现EC615质粒(Tpinv)与Tp质粒同源性为>99%,唯一的区别在于shufflon区域的一个重复序列发生了倒置。利用基因敲除技术,结果发现整个转移过程中,shufflon并不起关键作用。再次对质粒进行分析,我们发现大肠杆菌接受外源质粒的主要原因是基于“利益驱动”--大肠菌素(cib)。因此,本研究不仅成功建立了质粒在肠杆菌间水平转移的动物模型,而且找到了其转移的核心贡献因素--大肠菌素。